Évaluation de la phosphorylation des protéines intracellulaires induite par les cytokines stromales à l’aide de la cytométrie phospho-flow

Résumé

Source : Coats, J. S., et al. Expression de cytokines exogènes dans des xénogreffes dérivées de patients par injection avec une lignée cellulaire stromale transduite par cytokines. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Cette vidéo démontre l’évaluation de la phosphorylation intracellulaire des protéines induite par les cytokines stromales dans les cellules leucémiques. Ces protéines phosphorylées intracellulaires sont quantifiées à l’aide de la technique de cytométrie phospho-flux.

Protocole

1. Tests de cytométrie en flux phospho pour évaluer l’activité des cytokines produites par le stroma

REMARQUE : Évaluez le surnageant du stroma modifié avant la première expérience pour vérifier la bioactivité pertinente de la cytokine générée par le stroma pour l’expérience individuelle. Une fois que le stroma modifié est validé, il n’est pas nécessaire d’effectuer d’autres tests, à moins d’introduire des stroma produits avec un nouveau vecteur.

1. Achetez des lignées cellulaires de leucémie MUTZ5 et/ou MHH-CALL4 (répondant au TSLP), des cytokines humaines recombinantes et des anticorps approuvés pour une utilisation dans les tests de cytométrie phospho-flux afin de détecter les cibles de phosphorylation en aval appropriées.
2. Décongélation du surnageant récolté à partir du stroma témoin et exprimant des cytokines.
3. Plaquez les lignées cellulaires de leucémie dans un milieu R20 (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 0,2 x 10⁶ cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Plaque 3 puits par condition pour permettre des tests en trois exemplaires. Incuber pendant 2 h à 37 °C. Ce temps permet de perdre toute phosphorylation qui s’est produite dans des conditions de culture antérieures.
   REMARQUE : 12 puits par lignée cellulaire permettent d’obtenir des tests en trois exemplaires pour chaque condition expérimentale illustrée à l’étape 1.4.
4. Après 2 h de culture, transvaser les cellules de chaque puits dans des tubes séparés de 4 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min, à 4 °C. Décanter le surnageant.
   1. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL pour chacune des conditions expérimentales suivantes (effectuer des tests en trois exemplaires) : 1) milieux témoins négatifs seulement, 2) milieux témoins positifs avec cytokines recombinantes à des concentrations saturantes (TSLP à 15 ng/mL, etc.), 3) stroma surnageant témoin du stroma témoin, et 4) stroma-stroma surnageant à partir du stroma producteur de cytokines.
5. Incuber les cellules pendant la durée spécifiée par un dosage phosphologique commercial spécifique (par exemple 30 min pour le phospho-STAT5 dans MUTZ5 ou MHH-CALL4 en réponse à TSLP).
6. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et décanter le surnageant.
7. Effectuez une coloration par cytométrie phospho-flux selon le protocole du fabricant et collectez des données de cytométrie en flux.
8. Analysez les données de cytométrie en flux.
   1. Porte sur les cellules intactes en fonction de la diffusion de la lumière vers l’avant (FSC, indique la taille de la cellule) et latérale (SSC, indique la granularité de la cellule).
   2. Déterminez l’intensité fluorescente médiane (IMF) des cellules intactes dans chaque échantillon. Comparez l’IMF moyenne obtenue à partir des valeurs triples du surnageant des cellules stromales à celles des témoins de milieux positifs et négatifs.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipettes sérologiques de 10 mL	Faucon	357551
Tubes coniques en polypropylène de 15 mL	pêcheur	Tél. : 05-539-12
Tubes coniques en polypropylène de 50 ml	Faucon	352098
Pointes de pipette de 1 mL	pêcheur	2707509
Pointes de pipette de 200 μL	Denville Scientific	P3020-CPS
Pointes de pipette de 10 μL	Denville Scientific	P-1096-CP
Milieu de culture cellulaire « R20 », % du volume total (pour une dose de 195 ml)			Recette de laboratoire
RPMI, 76,84 % (150 ml)	Médiatech	10-040-CV
FBS, 20,49 % (40 ml)	Médiatech	35-011-CV
2 mM de L-glutamine, 1,02 % (2 mL)	Médiatech	35-011-CV
1 mM de pyruvate de Na, 1,02 % (2 mL)
Pénicilline-streptomycine, 0,51 % (1 mL	Médiatech	30-002-CL
2-Mercaptoéthanol, 0,10 % (0,1 M), 0,10 % (200 μL)	Député	190242
Produits biologiques
Lignée cellulaire MHH-CALL-4 « CALL-4 », leucémie précurseur des lymphocytes B humains	DSMZ	ACC 337
Lignée cellulaire MUTZ-5, leucémie précurseur des lymphocytes B humains	DSMZ	ACC 490
Protéine TSLP humaine recombinante	Systèmes de R&D	Référence 1398-TS-010
Anticorps de cytomère en flux (clone)*
Anti-souris CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (l’autre nom est IL-7Rα)	Miltenyi Biotec	Référence : 130-098-094
CD34 APC (8G12)	BD Biosciences	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBiosciences	Référence 25-0459
« FVD » Colorant de viabilité fixable eFluor 780	eBiosciences	Référence 65-0865
Ig κ chaîne légère FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Chaîne légère Ig λ FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	BioLégende	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Biosciences	551079
pSTAT5 PE, souris anti-STAT5 (pY694)	BD PhosphoFlow	612567
Autres matériaux et équipements
Logiciel d’analyse par cytométrie en flux FlowJo	FlowJo, LLC	Édition 10
*Tous les anticorps sont anti-humains, sauf indication contraire.