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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des tissus pour la fixation et l’enrobage de paraffine
NOTE : Des biopsies ont été prélevées sur des femmes consentantes subissant une cystoscopie avec électrofulguration de la trigonite pour la prise en charge avancée de l’infection urinaire récurrente (infection urinaire). L’infection urinaire récurrente est définie comme 3 infections urinaires en 12 mois. La biopsie a été effectuée dans la salle d’opération pendant que le patient était sous anesthésie après avoir obtenu le consentement éclairé du patient. Tous les échantillons ont été codés et anonymisés avant l’expérimentation.
- Obtenir une biopsie à la tasse froide (~1 mm3) du trigone vésical à l’aide d’une pince urologique à l’aide d’un cystoscope flexible et la placer immédiatement dans un cryoflacon stérile de 2 mL contenant 1,5 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % v/v préparé dans 1 solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE : 4 % de PFA dans 1x PBS peut être préparé à l’avance et stocké à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Biopsie fixe pendant 6 h à température ambiante ou pendant 16-24 h à 4 °C.
REMARQUE : La durée de fixation doit être calculée en fonction de la taille de l’échantillon de tissu et une fixation excessive doit être évitée. Il n’est pas conseillé d’utiliser le glutaraldéhyde comme fixateur car il introduit l’autofluorescence.
- Dans une hotte stérilisée ou une enceinte de biosécurité, retirez le fixateur par pipetage et remplacez-le par 1,5 mL de solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS). Conservez les échantillons à 4 °C pendant la nuit ou effectuez immédiatement le traitement des tissus et l’enrobage de paraffine.
- Utilisez un microtome stérilisé pour sectionner des blocs de tissus d’une épaisseur de 5 μm et collez des sections de tissu de paraffine sur des lames de microscope en verre chargé. Un minimum de deux lames par biopsie sera nécessaire pour le protocole d’hybridation in situ en fluorescence de l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S).
REMARQUE : Le tissu de biopsie doit être disposé en coupe transversale par rapport au plan de coupe afin d’assurer la visualisation des couches urothéliales dans toutes les sections. Il convient également de noter que l’épaisseur de la section doit être optimisée pour la détection de la communauté bactérienne. Des coupes plus minces ou un échantillonnage de plusieurs sections en série peuvent être nécessaires dans le cas d’infections où les bactéries résidentes dans les tissus sont extrêmement rares (p. ex., <1 bactérie résidente dans les tissus pour 1 000 cellules de mammifères).
2. Hybridation in situ en fluorescence avec des sondes universelles d’ARNr 16S
REMARQUE : Deux lames par biopsie sont nécessaires. Une lame est nécessaire pour la sonde universelle à ARNr 16S et une lame pour une sonde de contrôle avec une séquence brouillée. Ceci est important pour distinguer le signal vrai du signal de fond pendant la microscopie, car l’épithélium de la vessie est auto-fluorescent dans plusieurs canaux. En plus de la sonde de brouillage, le blocage avec 0,1 % de Sudan Black B avant le montage peut réduire l’autofluorescence de fond inhérente au tissu.
- Préparation des réactifs et de la hotte
- Nettoyez une hotte vide (ou une enceinte de biosécurité correctement installée) avec de l’éthanol à 70 %.
- Préparez le tampon d’hybridation composé de 0,9 M de chlorure de sodium (NaCl), de 20 mM de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris-HCl, pH 7,2), de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 % dans 10 mL d’eau stérile filtrée.
REMARQUE : L’eau filtrée stérile peut être préparée en faisant passer de l’eau distillée autoclave à travers un filtre de 0,22 μM. Le tampon d’hybridation peut être stocké à température ambiante, mais la FDS peut précipiter de la solution. En cas de précipitation du SDS, réchauffer la solution dans un bain-marie à 50 °C avant utilisation.
- Préparez au moins 100 ml d’éthanol à 95 % et à 90 % d’éthanol dans de l’eau filtrée stérile dans des bouteilles lavées et autoclavées.
- Dissoudre les sondes lyophilisées marquées par fluorescence dans 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM de tampon d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) préparés dans de l’eau exempte de nucléases stérilisée par filtre jusqu’à une concentration finale de 100 μM. Préparer une dilution de 1 μM dans un tampon TE à utiliser dans le présent protocole. Stocker à -20 °C à l’abri de la lumière à la fois des sondes concentrées de 100 μM et des sondes reconstituées de 1 μM><.
REMARQUE : Ne dissolvez pas les sondes marquées par fluorescence dans l’eau. Un tampon est nécessaire pour empêcher l’hydrolyse de la liaison ester N-hydroxysuccinimide (NHS) conjuguant le fluorophore à la sonde nucléotidique.
- Nettoyez cinq bocaux Coplin avec de l’éthanol à 70 % (EtOH), laissez sécher, étiquetez comme suit : xylènes I, xylènes II, 95 % EtOH, 90 % EtOH, eau bidistillée (ddH2O) et remplissez avec 100 mL de la solution appropriée. Cela permettra d’éviter toute confusion dans les étapes ultérieures.
- Déparaffinisation et réhydratation des tissus
- Dans la capuche, placez deux lames par biopsie dans un support de lames vertical.
- Placez une grille coulissante verticale dans le bocal de xylènes I Coplin (contenant 100 ml de xylènes) pendant 10 min.
- Retirez la grille coulissante des xylènes I et épongez le fond sur une serviette en papier pour enlever l’excès de xylènes. Placer dans le bocal Coplin xylenes II pendant 10 min
REMARQUE : Ne travaillez jamais avec des xylènes en dehors d’une hotte certifiée.
- Réhydratez des coupes de tissus déparaffinisés lors de lavages successifs à l’éthanol (95 % et 90 %) pendant 10 minutes chacune dans les pots Coplin respectivement étiquetés.
REMARQUE : Au cours de cette étape, réchauffez le tampon d’hybridation à 50-56 °C dans un bain-marie.
- Retirez la grille coulissante du lavage à 90 % d’éthanol, épongez le fond sur du papier absorbant pour éliminer l’excès d’éthanol et placez-le dans le pot Coplin ddH2O contenant 100 ml de ddH2O stérilisé par filtre pendant 10 min.
- En attendant le lavage ddH2O, diluez les sondes à 10 nM dans un tampon d’hybridation pour créer la solution de coloration. Préparez 150 μL de solution de coloration par lame.
REMARQUE : Protégez la solution de coloration de la lumière en enveloppant les tubes dans du papier d’aluminium et en les rangeant dans un tiroir. Lorsque vous travaillez avec des sondes fluorescentes sur la paillasse, envisagez d’éteindre les plafonniers lorsque cela est possible. Les sondes diluées dans le tampon d’hybridation ne doivent pas être réutilisées.
- Hybridation et contre-coloration
- Préparez une chambre d’humidification pour chaque sonde en plaçant de l’eau Kimwipe et stérile trempée et froissée dans le réservoir d’une boîte d’embouts P1000. Placez la cartouche porte-embout sur le dessus - c’est là que les diapositives seront placées.
REMARQUE : Il est important d’utiliser une chambre d’humidification pour éviter que les sections de biopsie ne se dessèchent pendant l’hybridation. Il convient de noter que les chambres d’humidification disponibles dans le commerce sont conçues pour maintenir une atmosphère stable et humide. Cependant, la technique détaillée ici contrôle suffisamment l’humidité à un coût nettement inférieur.
- Retirez les diapositives du support à diapositives et placez-les sur une serviette en papier fraîche (côté mouchoir vers le haut). Utilisez un Kimwipe pour sécher la lame. Veillez à ne tamponner doucement qu’à proximité (et non sur) la section de biopsie pour évacuer l’eau. À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracez une bordure autour de la section de biopsie et placez le tissu de la lame côté vers le haut dans la chambre d’humidification.
REMARQUE : Travaillez rapidement pour que les tissus ne se dessèchent pas avant l’hybridation.
- Placez la chambre d’humidification dans un incubateur réglé à 50 °C. Pipette 50-150 μL de la solution de coloration directement sur le tissu de sorte que le rectangle formé par la bordure hydrophobe autour du tissu soit rempli. Attention à ne pas ajouter trop de solution pour faire déborder la bordure hydrophobe. Fermez la boîte délicatement.
- Incuber toute la nuit (~16 h) à 50 °C dans l’obscurité. Si l’incubateur est doté d’une fenêtre, couvrez-la d’une feuille d’aluminium pour créer un environnement sombre.
REMARQUE : Une température d’hybridation inférieure à la température de fusion de la sonde FISH est nécessaire pour un signal fiable. 50 °C est la température optimale pour la sonde universelle 16S à ARNr, mais peut ne pas l’être pour d’autres sondes.
- Le lendemain matin, préparer au moins 500 ml de tampon de lavage composé de 0,9 M de chlorure de sodium (NaCl) et de 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2) dans du jdH2O et filtrer la stérilisation dans une bouteille stérile avec un filtre sous vide. Chauffer à 50-56 °C au bain-marie.
- Retirez les lames des chambres d’humidification et évacuez soigneusement toute solution d’hybridation restante avec un Kimwipe. Placez les lames dans un support de coloration vertical.
- Placez la grille de coloration dans un bocal Coplin opaque contenant 100 ml de tampon de lavage préchauffé pendant 10 min. Si les bocaux Coplin ne sont pas opaques (par exemple, en verre), placez-les dans l’obscurité pendant les étapes d’incubation, peut-être sous une boîte ou dans un tiroir.
- Répétez l’étape de lavage deux fois avec un tampon de lavage frais dans de nouveaux pots Coplin.
- Pendant les étapes de lavage, préparez la contre-teinture en diluant une solution mère de 100 μg/mL de Hoechst 33342 1:1 000 dans le tampon de lavage. Dans le même tube, ajoutez l’agglutinine de germe de blé Alexa-555 (WGA) à une concentration finale de 5 μg/mL et la phalloïdine Alexa-555 à une concentration finale de 33 nM. Conserver dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
REMARQUE : Hoechst, Alexa-555 WGA et Alexa-555 Phalloïdin marquent respectivement l'acide désoxyribonucléique (ADN), la mucine/uroplakines et l'actine et peuvent être stockés à long terme dans l'obscurité conformément aux instructions du fabricant. Les étiquettes fluorescentes utilisées pour les sondes et les contre-colorants peuvent être personnalisées en fonction des ensembles de filtres disponibles pour le microscope à utiliser.
- Retirez les lames du dernier lavage et évacuez doucement l’excès de tampon de lavage avec un Kimwipe. Placez les lames côté tissu vers le haut sur une serviette en papier et ajoutez 50 à 150 μL de contre-coloration directement sur le tissu afin que la bordure hydrophobe soit remplie, mais ne déborde pas. Couvrez jusqu’à quatre lames avec le dessus d’une boîte cryogénique et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
- Remettez les côtés dans la grille de coloration et lavez-les deux fois de plus dans des bocaux Coplin avec un tampon de lavage frais, pendant 10 minutes chacun.
- Séchez soigneusement les lames après le dernier lavage et placez-les côté mouchoir vers le haut sur une serviette en papier sous le dessus d’une boîte cryogénique. Pressez une goutte de support de montage directement sur le tissu. Placez délicatement une lamelle de taille appropriée (en fonction de la taille de la biopsie) sur le dessus. Appuyez doucement sur les bulles car elles interféreront avec l’imagerie et laissez les lames glissées durcir toute la nuit dans l’obscurité.
- Le lendemain, scellez les bords de la lamelle sur la lame avec une légère couche de vernis à ongles transparent. Laisser sécher 10 min dans l’obscurité puis conserver dans l’obscurité à 4 °C pour la microscopie confocale.
3. Visualisation de l’ARNr 16S FISH par microscopie confocale
REMARQUE : Pour ce protocole, les meilleurs résultats sont obtenus avec un microscope confocal à balayage laser avec des objectifs 63x et 100x. Des jeux de filtres appropriés pour la visualisation de la fluorescence Hoechst, Alexa-488 et Alexa-555 sont nécessaires. Cependant, la microscopie fluorescente standard peut être utilisée si un microscope confocal n’est pas disponible. Ce protocole concerne un microscope confocal à balayage laser.
- Allumez le microscope confocal et le logiciel informatique associé au microscope conformément aux instructions du fabricant.
- Chargez la diapositive et visualisez avec l’objectif 10x dans le canal bleu (Hoechst). Concentrez-vous soigneusement jusqu’à ce que les noyaux soient visibles.
- Une fois la mise au point effectuée, passez l’objectif à un grossissement élevé (63x ou 100x). Ajoutez de l’huile sur la lamelle. Refaites la mise au point avec le nouvel objectif, en vous assurant que la lentille de l’objectif entre en contact avec l’huile pendant la mise au point.
REMARQUE : N’utilisez que la mise au point fine à fort grossissement (63x ou 100x). L’huile ne doit être utilisée que dans un but pétrolier.
- Évaluez rapidement chaque lame à travers l’oculaire dans le canal vert (protéine fluorescente verte améliorée, eGFP/Alexa-488) pour déterminer quelles lames sont positives pour FISH et lesquelles sont négatives pour FISH.
REMARQUE : Il est préférable que cette évaluation/notation initiale soit effectuée à l’insu d’une personne distincte afin de réduire le biais expérimental.
- Pour imager les biopsies colorées, commencez avec une lame positive à FISH et passez en mode de visualisation par ordinateur. Sélectionnez les canaux 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) et 555 (Alexa-555). Réglez le sténopé à l’aide du canal de longueur d’onde le plus long, dans ce cas 555. Trouvez le plan focal correct pour la visualisation des bactéries marquées dans le canal 488. Sans modifier le plan focal, réglez le gain, la puissance laser et le décalage pour chaque canal de sorte que le signal ne soit pas saturé et que l’arrière-plan ne soit pas sur-corrigé. Acquisition de l’image dans les trois canaux.
REMARQUE : Utilisez les mêmes paramètres pour le canal 488 afin d’imager chaque lame d’une expérience. La puissance du laser peut nécessiter un réglage dans les canaux 405 et 555 si le plan focal optimal pour la visualisation bactérienne change entre les champs.