Une technique in vitro pour la génération de lymphocytes T apoptotiques par irradiation UV

Résumé

Source : Hodge, M. X., et al. Évaluation in vivo de l’efférocytose des macrophages alvéolaires suite à une exposition à l’ozone. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode pour induire l’apoptose dans les cellules Jurkat - une lignée cellulaire de leucémie à lymphocytes T humains. Les cellules sont exposées au rayonnement ultraviolet C (UVC), qui cause des dommages importants à l’ADN et conduit à la mort cellulaire apoptotique.

Protocole

1. Préparation de la lignée de cellules T Jurkat (Jour 2)

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.

1. Cellules T Jurkat de culture dans 24 mL de milieu de culture basocellulaire + 10 % FBS + 5 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C + 5 % de CO₂ (tableau des matières). Les lymphocytes T Jurkat sont une lignée de cellules en suspension qui peut être maintenue en passant 1:6-1:8 dans un milieu de culture préchauffé tous les 3 jours. Ne pas secouer.
2. Pour préparer les cellules apoptotiques, faites-les croître jusqu’à 90 % de confluence dans chaque flacon (ce qui prend 3 à 4 jours après le passage). Pour cette étude, utilisez des cellules provenant de cinq flacons T75 afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules utilisées dans ce protocole.
   note: Un flacon confluent contient environ 20 à 24 millions de cellules.
3. Pipeter les cellules (c’est-à-dire la fiole entière) de chaque fiole (environ 24 ml) et transférer les cellules dans un tube conique stérile de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique. Utilisez plusieurs tubes coniques pour plusieurs flacons.
4. Compter les cellules en prélevant une aliquote de 11 μL de cellules du tube conique de 50 mL et mélanger avec 11 μL de colorant bleu de trypan et pipeter 11 μL sur les lames de l’hémocytomètre.
5. Insérez la diapositive dans un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre de cellules vivantes pour calculer le nombre total de cellules dans chaque fiole en multipliant le nombre de cellules vivantes par 24, car chaque fiole contient 24 mL de support.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 271 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) sur des cellules à granulés.
7. Jeter le surnageant par aspiration et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu pour obtenir 3,0 x 10⁶ cellules par ml.
8. Aliquote 5 mL de cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm x 20 mm (environ neuf boîtes seront utilisées ; la quantité totale de cellules dans chaque boîte doit être de ~15 x 10⁶).
9. Utilisez une parabole pour le contrôle/non exposée, et les paraboles restantes seront exposées aux UV.
10. Réglez le réticulant UV sur le bon niveau d’énergie, appuyez sur le bouton d’énergie et entrez « 600 » à l’aide du pavé numérique, que la machine indiquera comme 600 μJ/cm² x 100.
    note: Les unités d’énergie de la réticulation UV sont en μJ/cm² x 100 ; par conséquent, pour obtenir 60 millijoules/cm², convertissez les unités pour qu’elles correspondent à l’agent de réticulation UV.
11. Irradiez toutes les paraboles avec des cellules, à l’exclusion du contrôle, à 60 millijoules (mJ)/cm² à l’aide de la réticulante UV. Retirez le couvercle supérieur des boîtes de culture tissulaire lors d’une exposition aux UV, car la lumière UV ne pénétrera pas dans le couvercle en plastique.
12. Incuber toutes les boîtes dans un incubateur de culture cellulaire, y compris le contrôle non exposé, à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 4 h.
13. Confirmer l'apoptose par cytométrie en flux à l'aide d'une trousse de détection du dosage de l'apoptose contenant de l'annexine V et de l'iodure de propidium (PI) (marqueurs de l'apoptose et de la nécrose, respectivement) après 4 h d'incubation, conformément aux instructions du fabricant.
    note: L’irradiation des lymphocytes T Jurkat dans le réticulant UV à un niveau d’énergie de 600 μJ/cm², après une incubation de 4 heures, conduira à ≥75 % des cellules apoptotiques (précoces et tardives) ayant plus de phénotype apoptotique précoce que de phénotype apoptotique tardif. Cela permet aux macrophages alvéolaires de les reconnaître plus facilement et de les engloutir car leurs membranes ne sont pas compromises, contrairement aux cellules apoptotiques tardives, ce qui conduit à un indice efférocytaire plus élevé et à une imagerie plus précise de l’efférocytose des macrophages alvéolaires dans cette étude.
    1. Regrouper 333 μL (1 x 10⁶ cellules) de cellules T Jurkat provenant de plusieurs boîtes (à la fois « sans UV » et « exposées aux UV ») pour les utiliser comme tubes d’analyse de compensation.
    2. Aliquote 333 μL de lymphocytes T Jurkat dans une coloration unique à l’annexine V, une coloration unique PI, sans contrôle UV, et des tubes de cytométrie en flux marqués à 600 μJ/cm² exposés aux UV.
    3. Tubes à centrifuger à 188 x g pendant 5 min à RT et décanter le surnageant.
    4. Lavez les cellules en les remettant en suspension dans 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide.
    5. Centrifugeuse et cellules de granulés à 188 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant après centrifugation.
    6. Préparez 400 μL de 1 tampon de liaison par tube d’écoulement en diluant 10 tampons de liaison avec de l’eau distillée pendant que les cellules sont en centrifugation.
    7. Préparez le réactif d'incubation à l'annexine V et à l'annexe PI (100 μL par échantillon/tube) selon les instructions du fabricant.
    8. Décantez le surnageant après la centrifugation et remettez doucement tous les tubes en suspension dans 400 μL de 1x tampon de liaison, puis ajoutez 100 μL de réactif d’incubation d’annexine V dans chaque tube d’échantillon. Enfin, ajoutez 100 μL d’annexine V et PI dans leurs tubes respectifs, mais n’ajoutez rien au-delà du tampon de liaison 1x dans le tube non coloré.
    9. Incuber les tubes dans l’obscurité pendant 15 min à RT.
    10. Centrifuger toutes les cellules à 188 x g pendant 5 min à RT et décanter le surnageant.
    11. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de liaison 1x, puis analyser les échantillons pour l’apoptose par cytométrie en flux. Collecter au moins 10 000 événements par tube pour permettre une représentation précise de la coloration.
14. Combiner toutes les cellules irradiées des boîtes dans un tube conique de 50 mL et des cellules à granulés par centrifugation à 271 x g pendant 5 min à RT.
15. Éliminer le surnageant du tube par aspiration et remettre les cellules en suspension dans 24 mL de cellules salines stériles tamponnées au phosphate (PBS) et de granules par centrifugation à 271 x g pendant 5 min à température ambiante.
16. Éliminer le surnageant du tube par aspiration et remettre en suspension les cellules dans la quantité de PBS utilisée pour le dosage des souris approuvé par l’IACUC. La dose utilisée est comprise entre 5 et 10 x 10⁶ cellules/50 μL par souris ; par conséquent, pour 10 souris, remettre en suspension dans 500 μL (le nombre de cellules dans chaque dose varie en fonction du nombre de cellules cultivées pour l’irradiation).
    note: Faites au moins deux doses supplémentaires pour tenir compte de tout liquide qui pourrait coller aux côtés de la pointe de la pipette, entraînant la perte de cellules.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit Annexin V-FITC	Trévigen	4830-250-K	Le kit TACS Annexin V-FITC permet une identification rapide, spécifique et quantitative de l’apoptose dans des cellules individuelles lors de l’utilisation de la cytométrie en flux.
Cellules T BCL2 Jurkat	ATCC	ATCC CRL-2899	La lignée cellulaire BCL2 Jurkat a été dérivée par transfection de cellules T Jurkat humaines avec le vecteur d’expression pSFFV-neo mammifère contenant l’insert ORF BCL-2 humain et un gène résistant à la néomycine. A été pour des modèles de mesure de l’efférocytose.
Compteur de cellules automatisé Countess II	Thermopêcheur	AMQAX1000	Il s’agit d’une plate-forme de test de paillasse équipée d’optiques de pointe, d’un autofocus complet et d’un logiciel d’analyse d’images pour l’évaluation rapide des cellules en suspension. Très facile à utiliser.
Cytospin 4 Cytocentrifugeuse	Thermopêcheur	A78300003	Fournit des préparations économiques en couches minces à partir de n’importe quelle matrice liquide, en particulier des fluides hypocellulaires tels que le liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Sérum fœtal bovin, qualifié, inactivé par la chaleur	Thermopêcheur	16140071	Fournit des nutriments aux cellules cultivées pour qu’elles se développent. C’est la norme pour la culture cellulaire.
Pénicilline-streptomycine	Sigma/Aldrich	Réf. P0781-100ML	La pénicilline-streptomycine est la solution antibiotique la plus couramment utilisée pour la culture de cellules de mammifères. De plus, il est utilisé pour maintenir des conditions stériles pendant la culture cellulaire.
RPMI 1640 Moyen, Supplément GlutaMAX	Thermopêcheur	61870036	Le milieu RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) a été développé à l’origine pour cultiver des cellules leucémiques humaines en suspension et en monocouche. Le milieu RPMI 1640 s’est depuis avéré convenir à une variété de cellules de mammifères, notamment HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, les astrocytes et les carcinomes. Aide à la croissance rapide et efficace des lymphocytes T Jurkat.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Réticulant	Cambridge Scientific	Référence 16659	Le réticulant UV Stratalinker est conçu pour induire l’apoptose, réticuler l’ADN ou l’ARN sur des membranes de nylon, de nitrocellulose ou de nitrocellulose renforcée de nylon.