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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des échantillons
- Prélever du sang périphérique dans des tubes héparinés de 9 mL et maintenir l’échantillon à température ambiante (RT) dans un rotor jusqu’à ce qu’il soit requis pour le protocole expérimental.
- Étiquetez les tubes cytométriques de 5 mL pour les témoins négatifs (2 tubes), les témoins positifs (2 tubes) et les différentes concentrations d’allergène/médicament (1 tube pour chaque concentration d’allergène/médicament testée). Placez les tubes dans un support où les tubes s’emboîtent parfaitement sans glisser.
- Préparez le tampon de stimulation dans de l’eau doublement distillée contenant 2 % (v/v) d’HEPES, 78 mg/L de NaCl, 3,7 mg/L de KCl, 7,8 mg/L de CaCl2, 3,3 mg/L de MgCl2, 1 g/L de HSA. Ajustez le pH à 7,4 et ajoutez de l’IL-3 à 2 ng/mL. Habituellement, préparez 100 mL et divisez-les en aliquotes de 2,5 mL à congeler à -20 °C.
- Préparer des témoins positifs dans PBS-Tween-20 0,05 % (v/v) (PBS-T) : Contrôle positif 1, N-Formyl méthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) (4 μM), pour confirmer la qualité des basophiles ; Contrôle positif 2, anti-IgE (0,05 mg/mL) en tant que contrôle positif médié par les IgE.
- Préparez l’allergène/médicament dans le PBS-T à 2x la concentration finale souhaitée.
note: Les concentrations optimales d’allergènes/médicaments à utiliser doivent être déterminées au préalable à l’aide d’une large gamme de concentrations, de courbes dose-réponse et d’études de cytotoxicité suivant les mêmes étapes du protocole.
2. Préparation du mélange de coloration
- Ajoutez des anticorps monoclonaux marqués au fluorochrome dans le tampon de stimulation en suivant la concentration d'anticorps recommandée par le fabricant ou par titrage antérieur des anticorps. Dans ce protocole, nous ajoutons 1 μL de chaque anticorps (CCR3-APC et CD203c-PE pour l’identification des basophiles ; CD63-FITC pour l’activation des basophiles) par 20 μL de tampon de stimulation.
note: Protégez la préparation du mélange de coloration de la lumière.
- Ajouter 23 μL de mélange de coloration dans chaque tube.
3. Stimulation sanguine
- Ajouter 100 μL de PBS-T dans les tubes 1 et 2 (témoin négatif), 100 μL de fMLP dans le tube 3, 100 μL d’anti-IgE dans le tube 4 et 100 μL des différentes concentrations d’allergènes/médicaments dans les tubes suivants. Incuber pendant 10 min à 37 °C dans un bain thermostatique avec une agitation moyenne pour préchauffer les réactifs.
- Ajoutez doucement 100 μL de sang dans chaque tube pour éviter l’hémolyse. Agiter doucement les tubes tourbillonnaires et incuber pendant 25 min à 37 °C dans un bain thermostatique à agitation moyenne.
- Arrêtez la dégranulation en maintenant les tubes à 4 °C pendant au moins 5 min.
note: Le protocole peut être interrompu ici à 4 °C pendant 30 à 45 minutes si nécessaire.
4. Lyse des érythrocytes
- Ajouter 2 ml de 1 tampon de lyse dans chaque tube pour lyser les érythrocytes. Vortex chaque tube et incuber pendant 5 min à RT.
note: Dans cette étape, les cellules sont fixées grâce à des agents fixateurs (formaldéhyde) contenus dans le tampon.
- Centrifuger à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Décantez le surnageant en renversant le support dans un évier. Les cellules restent au fond des tubes.
- Ajouter 3 ml de PBS-T dans chaque tube pour laver les cellules. Vortex chaque tube.
- Centrifuger à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Décantez le surnageant en renversant la grille dans un évier.
note: Conserver les échantillons à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à l’acquisition du cytomètre en flux.
5. Acquisition par cytométrie en flux
- Acquérir des échantillons par cytomètre en flux (p. ex., BD FACSCalibur Flow Cytometer). Connectez le cytomètre en flux au logiciel de l’ordinateur et attendez que le cytomètre soit prêt. Chargez le modèle et les paramètres de l’instrument (Tableau 1).
- Lancez l’acquisition de l’échantillon.
- Utilisez les stratégies de cytométrie suivantes pour la sélection des basophiles activés.
- Gate les lymphocytes à partir du graphique Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
- Porte les basophiles de la population lymphocytaire sous forme de cellules CCR3+CD203c+. Acquérir au moins 500 basophiles par tube.
- Montrez un tracé CCR3 - CD63 pour analyser l’activation en utilisant CD63 comme marqueur d’activation. Réglez le seuil négatif du CD63 à environ 2,5 % à l’aide des tubes de contrôle négatifs.
- Acquérez tous les échantillons.
Tableau 1 : Exigences pour le cytomètre en flux
| Sources lumineuses (lasers) | Laser argon-ion Coherent SapphireTM refroidi par air 488 nm ; 20 mW ; laser JDS UniphaseTM HeNe 633 nm refroidi par air ; 17 mW |
| Longueur d’onde excitatrice lumineuse | Laser bleu : 488 nm ; Laser rouge : 633 nm |
| Puissance de la source lumineuse à la longueur d’onde excitatrice | Laser bleu : 20 mW ; Laser rouge : 17 mW |
| Filtres optiques | SSC : 488/10 ; FITC : 530/30, PE : 585/42, APC : 660/20 |
| Détecteurs optiques | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Détecteurs optiques | Laser argon-ion refroidi à l’air |
| Chemins optiques | BD octogone (ligne laser de 488 nm) ; BD Trigons (ligne laser de 633 nm) |