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1. Préparation des aiguilles de micro-injection
- Préparez des aiguilles d’injection capillaire en verre à paroi mince (1,0 OD/0,75 ID) à l’aide d’un appareil d’extraction de micropipettes avec les réglages suivants : pression d’air 200, chaleur 502, traction 90, vitesse 80, temps 70, temps d’air au début de la traction 5, temps d’air à la fin de la traction 5.
- À l’aide d’une pince à épiler fine, cassez la pointe de l’aiguille tirée de sorte que l’ouverture de la pointe ait un diamètre d’environ 10 μm.
2. Préparation des boîtes d’injection larvaire
- Rincez un peigne à gel d’une largeur d’environ 4 à 5 mm dans de l’eau stérile et laissez-le sécher.
- Préparez une solution d’agarose à haut point de fusion à 1,5-2 % dans un milieu E3 et passez au micro-ondes jusqu’à ce que la solution soit claire. Une fois refroidi, versez une partie de l’agarose dans une boîte de Pétri (100 x 15 mm) et remuez, en ajoutant juste assez d’agarose pour couvrir complètement le fond du plat.
- Une fois que la couche d’agarose s’est solidifiée, placez le peigne en gel rincé et séché sur le dessus de sorte que l’extrémité non peignée repose juste sur le dessus de la boîte de Pétri et que l’extrémité peignée touche l’agarose. Assurez-vous que le peigne est aussi horizontal que possible, en créant un angle de 30° par rapport à la couche inférieure d’agarose.
- Versez une petite quantité supplémentaire d’agarose à l’interface entre le peigne et la couche inférieure d’agarose afin que la couche d’agarose fraîche recouvre les puits du peigne. Laisser refroidir complètement avant de retirer le peigne. À l’aide d’une pointe de pipette, retirez les morceaux d’agarose en surplomb des puits.
- Versez le milieu E3 sur le moule d’injection et conservez-le à 4 °C.
- Avant chaque utilisation, remplacer par un milieu frais et des rampes d’injection chaudes à 28,5 °C pendant au moins une heure avant l’injection.
- Immédiatement avant les injections, remplacez l’E3 sur la rampe d’injection par un milieu E3 contenant 200 μg/ml d’éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne).
3. Préparation de l’inoculum de Streptococcus iniae (S. iniae)
- Préparez et autoclavez le milieu de bouillon Todd Hewitt complété par 0,2 % d’extrait de levure et 2 % de peptone protéose (THY+P) : 30 g/L de Todd Hewitt, 2 g/L d’extrait de levure, 20 g/L de peptone protéose. Pour les plaques de gélose, ajouter 14 g/L d’agar.
- Préparez les cultures bactériennes la veille des infections en pipetant une aliquote de 100 μl de bouillon bactérien congelé dans 10 ml de bouillon THY+P dans un tube scellé de 15 ml. Incuber toute la nuit sans agitation à 37 °C. Après 14 à 16 heures de croissance, utilisez la culture de nuit soit pour faire des stocks de congélation, soit pour préparer une utilisation en injections.
- Préparez des bouillons de congélation en plaçant 1 ml de la culture de nuit dans 500 μl de glycérol à 80 % dans un tube à centrifuger de 1,7 ml. Pour éviter les cycles de congélation-décongélation, faites des aliquotes à usage unique de 100 μl à partir de ce mélange et conservez-les à -80 °C.
- Pour S. iniae utilisé dans les infections, diluer la culture de nuit 1:100 pour un volume total de 10 ml de culture en ajoutant 0,1 ml de culture de nuit à 9,9 ml de bouillon THY+P. Cultiver à 37 °C sans agitation pendant environ 4-5 heures. Surveillez la densité optique (DO) à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop et récoltez les bactéries dans une phase logarithmique moyenne lorsque la DO 600 nm atteint 0,250-0,500. Une DO 600 nm de 0,250 correspond à environ 108 unités formant colonies (UFC)/ml.
- Granulez 1 ml de la culture bactérienne dans un tube à centrifuger de 1,7 ml à 1 500 x g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 1 ml de solution saline fraîche tamponnée au phosphate (PBS) et répéter. Mesurez la DO 600 nm des bactéries dans le PBS, les granulés et les remettre en suspension dans le PBS pour atteindre la concentration souhaitée.
- Pour faciliter la visualisation de la microinjection, ajoutez du rouge de phénol aux suspensions bactériennes avant l’injection pour une concentration finale de 0,1 %.
- Pour les expériences impliquant l’injection de bactéries tuées par la chaleur, chauffer les bactéries dans du PBS à 95 °C pendant 30 min. Confirmer que le processus de destruction par la chaleur a réduit le nombre de bactéries viables à des niveaux indétectables en plaquant un volume d’injection (environ 1 nl) sur des plaques de gélose THY+P solide et en incubant pendant une nuit à 37 °C.
4. Marquage de S. iniae avec un colorant fluorescent rouge CellTracker
- Pour marquer les cellules bactériennes vivantes, préparez une solution mère d’un colorant fluorescent CellTracker ou équivalent. Comme le colorant utilisé se présente sous la forme de 20 aliquotes de 50 μg de poudre et doit être remis en suspension dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), ajoutez 7,3 μl de DMSO dans le tube pour obtenir une concentration de stock de 10 mM.
- Testez une gamme de concentrations de colorant (p. ex., 0,5 à 25 μM) sur les bactéries pour déterminer la concentration optimale la plus faible qui colore les cellules. Des cellules à division rapide et des expériences plus longues peuvent nécessiter une concentration plus élevée de colorant.
- Granuler 1,0 ml de culture bactérienne dans un tube de 1,7 ml par centrifugation comme décrit ci-dessus (section 3). Remettez la pastille en suspension dans 1 ml de PBS frais et ajoutez le volume approprié de colorant à la culture bactérienne.
- Incuber sans agitation à 37 °C pendant 30 min. Essorer les bactéries et les remettre en suspension dans 1 ml de bouillon THY+P préchauffé et incuber sans agitation pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C.
- Faites tourner les bactéries et lavez-les deux fois dans du PBS avant de mesurer la OD600 nm et de diluer les bactéries pour la micro-injection comme détaillé ci-dessus (section 3). Nous injectons généralement environ 100 UFC dans un volume d’injection de 1 nl pour nos études sur le recrutement des leucocytes et la phagocytose.
5. Préparation des larves de poisson-zèbre pour les infections
- Établissez des couples reproducteurs la veille et collectez les embryons comme décrit par Rosen et al.Incuber les embryons dans un milieu E3 à 28,5 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à infecter.
- Pour le poisson-zèbre qui sera imagé, prévenir le développement de pigments (mélanisation) en ajoutant de la N-phénylthiourée (PTU) au milieu E3 24 heures après la fécondation (hpf) pour une concentration finale de 0,2 nM.
- Pour les infections impliquant des embryons âgés de 2 jours après la fécondation (dpf), déchoraitez manuellement les embryons à l’aide d’une pince à épiler fine. Alternativement, déchorionnez les embryons en prélevant E3 et en les remplaçant par de la pronase (2 mg/ml) pendant environ 5 minutes ou jusqu’à ce qu’un pipetage doux sépare les embryons du chorion. La plupart des larves devraient avoir éclos naturellement d’ici 3 dpf.
- Anesthésier le poisson-zèbre plusieurs minutes avant l’infection en plaçant les larves déchoionnées dans un milieu E3 contenant 200 μg/ml de tricaïne.
6. Vésicule otique Injection de S. iniae dans des larves âgées de trois jours
- Allumez le micro-injecteur et réglez la plage de temps sur « milliseconde ». Ouvrez la vanne du réservoir de dioxyde de carbone pour laisser entrer le gaz dans la conduite. La pression du micro-injecteur doit être d’environ 20 livres par pouce carré (PSI). Ajustez la pression dans l’unité de micro-injecteur en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre le bouton moleté noir pour augmenter la pression ou en tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour diminuer la pression.
- Vortex la culture de S. iniae préparée dans du rouge de phénol et du PBS et utilisez une pointe de microchargeur pour charger 2-3 μl de la culture dans une aiguille d’injection capillaire tirée.
- Montez l’aiguille chargée sur un micromanipulateur relié à un support magnétique et placez-la sous un stéréomicroscope de manière à ce que l’aiguille soit à un angle d’environ 45 à 65° par rapport à la base du microscope.
- Appuyez sur la pédale du micro-injecteur pour distribuer une goutte de l’inoculum sur la pointe de l’aiguille. Mesurez le diamètre de la goutte à l’aide de la barre d’échelle située dans la lentille oculaire du microscope.
- Vous pouvez également estimer le diamètre de la goutte en injectant un volume dans une goutte d’huile minérale sur une lame de microscope en verre munie d’une barre d’échelle. Le diamètre de la goutte doit être d’environ 0,10 mm, ce qui correspond à un volume d’environ 1 nl.
- Ajustez la taille de la goutte en ajustant le réglage de la durée sur le micro-injecteur ou en coupant une partie plus importante de la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince à épiler fine. Notez que le temps d’injection doit être compris entre 20 et 35 ms pour éviter de causer trop de dommages aux tissus.
- À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez 12 larves anesthésiées dans chaque puits du moule d’injection.
- À l’aide d’une tige de verre, d’une boucle de cheveux ou d’une pointe en plastique, positionnez doucement les larves de manière à ce que les têtes soient dirigées vers l’arrière du microscope et que les sacs vitellins soient contre le côté gauche du puits. Pointez l’oreille gauche de la larve vers le plafond.
- En regardant à travers la lentille oculaire du stéréomicroscope, utilisez les boutons du micromanipulateur pour aligner l’aiguille chargée avec la vésicule otique afin que les deux soient dans le même champ de vision. Percez la couche épithéliale externe de la vésicule otique avec la pointe de l’aiguille de sorte que la pointe de l’aiguille se trouve juste à l’intérieur de la vésicule.
- Appuyez sur la pédale pour injecter 1 nl de la dose souhaitée de S. iniae. Assurez-vous d’utiliser une pression suffisamment basse pour ne pas rompre la cavité. Si l’injection réussit, la vésicule otique, mais pas le tissu environnant, doit être rempli d’inoculum rouge de phénol (Figure 1 Ai). Retirez immédiatement tout poisson mal injecté de la plaque d’injection.
- Rétractez soigneusement l’aiguille de la larve et déplacez la plaque d’injection à la main de manière à ce que la prochaine larve soit en vue. Faites-le sous un grossissement de 5X.
note: La rétraction de l’aiguille peut entraîner le dépôt de certaines bactéries à l’extérieur de la vésicule otique, ce qui peut fausser les résultats de survie et de recrutement des leucocytes. Pour éviter cela, il est recommandé d’injecter des bactéries marquées à un colorant fluorescent et de scanner visuellement les larves injectées sous un microscope fluorescent pour éliminer toutes les larves où cela s’est produit. Une larve correctement injectée est représentée (Figure 1 Bi).
- Pour s’assurer que le volume d’injection/l’inoculum reste le même tout au long de l’expérience, injectez une goutte de la suspension bactérienne dans un tube à centrifuger de 1,7 ml contenant 100 μl de PBS stérile tous les 48e embryons. Plaquer les 100 μl sur des plaques de gélose THY+P à 37 °C pendant la nuit pour déterminer la CFU dans le volume d’injection.
- Lorsque tout le groupe de 12 larves sur la rampe d’injection a été injecté, utilisez soigneusement une pipette de transfert en plastique pour retirer les larves des puits et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri (35 x 10 mm2). Retirer la solution de tricaïne et la remplacer par environ 2 ml de milieu E3 frais pour permettre aux larves de se rétablir.
- Pipette a injecté les larves dans des puits uniques d’une plaque de 96 puits et les a incubées à 28,5 °C. Surveiller la survie des larves au fil du temps dans ces plaques ou les retirer plus tard pour l’imagerie ou le comptage des UFC.
7. Fixation des larves pour l’imagerie
- Fixer les larves dans un paraformaldéhyde glacé à 4 % dans une solution de PBS comme décrit dans la rubrique 7.
- À température ambiante, laver 3 fois pendant 5 minutes chacune dans du PBS avant l’imagerie.
8. Préparation des larves pour l’imagerie en direct
- Préparez une solution d’agarose à faible point de fusion à 1,5 % dans E3 en la chauffant au micro-ondes jusqu’à ce que la solution soit claire.
- Placez la solution d’agarose dans un bain-marie à 55 °C pour la laisser refroidir mais pas durcir.
- Ajouter de la tricaïne à l’agarose jusqu’à une concentration finale de 0,016 %.
- À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, placez 4 à 5 larves anesthésiées dans une boîte à fond de verre sur la platine d’un stéréomicroscope.
- Retirez la solution de tricaïne et d’agarose du bain-marie à 55 °C et laissez-la refroidir à température ambiante pendant 1 à 2 min. Pendant que l’agarose refroidit, retirez autant de liquide que possible des larves anesthésiées.
- Versez l’agarose refroidie dans le plat jusqu’à ce qu’environ la moitié de la surface soit couverte. Agitez le plat pour étaler l’agarose. Notez que si l’agarose est trop chaude, elle tuera les larves. De plus, si une trop grande quantité d’agarose est ajoutée à la boîte, la lentille de l’objectif du microscope peut heurter le fond de la boîte lors de la mise au point à travers l’agarose.
- À l’aide d’une pipette de transfert, prélevez les larves qui ont flotté sur les parois du plat et remettez-les au centre.
- Sous le stéréomicroscope, positionnez doucement les larves comme vous le souhaitez à l’aide d’une boucle de cheveux, d’une longue pointe de pipette ou d’une tige de verre. Pour l’imagerie de la vésicule otique, positionnez les larves de manière à ce que la vésicule otique gauche soit à plat contre le fond de la boîte.
- Laissez refroidir l’agarose pendant environ 10 min avant de déplacer le plat. Les larves peuvent changer de position si l’agarose n’est pas solide. Pipetez doucement un peu de tricaïne et de solution E3 sur le dessus de la couche d’agarose pour la garder humide.
9. Imagerie confocale de l’infection
- Placez la parabole à fond de verre avec les larves sur la platine d’un microscope inversé équipé d’un système confocal à balayage laser FV-1000.
- Réglez le sténopé sur 200-300 μm et à l’aide d’un objectif à ouverture numérique 0,75/20X, réglez les piles z avec des tranches de 3 à 6 μm.
- Utilisez le balayage linéaire continu pour ajuster la puissance laser et le gain du détecteur pour chaque voie.
- À l’aide d’un balayage linéaire séquentiel pour chaque canal de fluorescence (par exemple, 488 et 543 nm) et contraste interférentiel différentiel (DIC), effectuez une vidéo en accéléré de la vésicule otique gauche toutes les 3 minutes pendant 2 à 6 heures pour observer le recrutement initial et la phagocytose par les neutrophiles et les macrophages. Pour les traitements de longue durée, placez un couvercle sur la boîte de Pétri pour éviter l’évaporation et le dessèchement de l’agarose.
- Acquérez des images fixes de larves fixes (figure 1B) ou vivantes (figure 2) à un grossissement de 20X ou 40X.
10. Photoconversion des leucocytes marqués au Dendra2 au niveau de la vésicule otique
REMARQUE : Dendra2 peut être photoconverti de la fluorescence verte à la fluorescence rouge en focalisant un laser de 405 nm (une puissance laser de 50 à 70 % devrait suffire) sur la région d’intérêt (ROI) pendant 1 min. Vous trouverez ci-dessous le protocole étape par étape utilisé pour le système confocal à balayage laser FV-1000 :
- Visualisez l’échantillon à l’aide d’un balayage z-stack avec les lasers 488 nm et 543 nm. Utilisez le balayage linéaire continu pour ajuster la puissance du laser et le gain du détecteur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fluorescence rouge photoconvertie accidentellement.
- Dans la fenêtre « Contrôle d’acquisition d’image », sous « Réglage du stimulus », sélectionnez l’outil « Utiliser le scanner » et choisissez « Principal ». Sélectionnez le laser de 405 nm et réglez-le à 70 % de puissance. À l’aide de l’option cercle, définissez la zone d’intérêt dans la vésicule otique.
- Sous « Réglage du démarrage du stimulus », sélectionnez « Activation en série » avec une préactivation de 1 image et un temps d’activation de 60 000 ms. Dans la fenêtre « Réglage d’acquisition » sous l’en-tête « Balayage temporel », choisissez 2 intervalles de 00:01:00 (un pour la pré- et un pour la post-photoconversion).
note: Une fois le balayage de la série time-lapse terminé, le Dendra2 devrait avoir été photoconverti à son état fluorescent rouge.
- Scannez l’échantillon à l’aide d’une pile z à l’aide des lasers de 488 nm et de 543 nm pour visualiser la fluorescence rouge photoconvertie ainsi que toute fluorescence verte restante (Figure 3).
