1. Cytométrie en flux et tri des sous-types de lymphocytes
REMARQUE : Le tri des lymphocytes en fonction du type de cellule est essentiel pour établir les étiquettes de type cellulaire de vérité terrain (c’est-à-dire correctes) pour entraîner et tester un classificateur de type cellulaire dans l’apprentissage supervisé. La cytométrie en flux, une méthode de référence, est utilisée pour identifier et séparer les lymphocytes.
- Fabriquer un mélange d’anticorps marqueurs de surface dans 100 μL de milieu RPMI-1640 frais [avec 10 % de FBS, 0,1 μg de CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) et NK1.1 (PK136)] et 0,25 μg d’anticorps CD4 (GK1.5) pour cibler les lymphocytes T B, CD4+ et CD8+.
- Ajouter 100 μL du mélange d’anticorps à la suspension cellulaire.
- Incuber 25 min sur glace.
- Laver les cellules en ajoutant 5 mL de PBS et en centrifugeant à 400 x g pendant 5 min à 4 °C, deux fois.
- Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu frais RPMI-1640 avec 10 % de FBS et 2,5 μg de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole).
- Prélever chaque type de lymphocytes séparément par cytométrie en flux en utilisant les niveaux de fluorescence des marqueurs décrits ci-dessus. Excluez simultanément les cellules mortes à l’aide des signaux DAPI.
2. 3D Imagerie de phase quantitative
- Gardez les lymphocytes triés sur de la glace tout au long des procédures d’imagerie, qui doivent être terminées dans les 5 heures (depuis l’isolement des lymphocytes de la souris) pour éviter les dommages cellulaires et les altérations biochimiques.
- Sélectionnez un type de cellule trié (parmi les lymphocytes T B, CD4+ et T CD8+) et diluez l’échantillon à 180 cellules/μL avec un milieu RPMI pour des conditions d’imagerie optimales (c.-à-d. une cellule par champ de vision unique).
- Chargez 120 μL de l’échantillon dilué dans une chambre d’imagerie par injection lente. Vérifiez soigneusement la présence de bulles dans la chambre d’imagerie avec l’échantillon. S’il y a des bulles, retirez-les soigneusement, car elles compromettront la qualité des mesures.
- Acquérez des tomogrammes IR 3D à l’aide d’un microscope de phase quantitatif 3D commercial, ou holotomographie, et de son logiciel d’imagerie.
REMARQUE : Des informations détaillées sur le dispositif expérimental se trouvent dans le manuscrit original.
- Placez une goutte d’eau distillée sur la lentille de l’objectif du microscope.
- Placez la chambre d’imagerie avec l’échantillon sur la platine de translation du microscope et ajustez son emplacement de manière à ce que l’échantillon s’aligne avec la lentille de l’objectif.
- Ajustez les positions axiales de l’objectif et des lentilles du condenseur en cliquant respectivement sur Focus et Surface dans l’onglet « Étalonnage » de la perspective « Microscope » du logiciel d’imagerie.
- Alignez les lentilles de l’objectif et du condenseur en cliquant sur Mode automatique. Vous pouvez également utiliser le mode de balayage et régler manuellement les objectifs de sorte que les motifs d’éclairage soient localisés dans la région centrale du champ de vision.
- Revenez au mode normal et ajustez l’étape de translation pour localiser une cellule dans le champ de vision.
- Trouvez le plan focal en ajustant la position axiale de l’objectif. Une mise au point parfaite rend la limite de l’échantillon visualisée à l’écran presque invisible.
- Ajustez l’étape de traduction pour trouver un emplacement sans cellule.
- Cliquez sur Calibrer pour mesurer plusieurs hologrammes 2D avec différents angles d’éclairage.
- Ajustez l’étape de translation pour localiser une cellule au centre du champ de vision.
- Allez à l’onglet « Acquisition » et cliquez sur Instantané 3D pour mesurer les hologrammes de la cellule avec des angles d’éclairage identiques à ceux de l’étape 2.4.8.
- Lorsque les données acquises sont présentées dans le panneau « Gestion des données », cliquez avec le bouton droit de la souris sur les données acquises et cliquez sur Traiter pour reconstruire un tomogramme IR 3D à partir des hologrammes mesurés aux étapes 2.4.8 et 2.4.10, à l’aide de l’algorithme de tomographie par diffraction implémenté dans le logiciel d’imagerie.
- Répétez les étapes 2.4.5 à 2.4.11 pour mesurer plus de 100 cellules afin de garantir la puissance statistique de l’apprentissage automatique.
- Toutes les images traitées à l’étape 2.4.11. peuvent être visualisées. Dans le panneau « Gestion des données », cliquez avec le bouton droit sur les données et cliquez sur Ouvrir pour visualiser les données. Cliquez sur Tomogramme RI dans le panneau « Gestionnaire de données ». Dans l’onglet « Préréglage », cliquez sur Charger et double-cliquez sur « lymphocyte.xml », qui est une fonction de transfert prédéfinie fournie par le logiciel d’imagerie pour visualiser le tomogramme selon les distributions 3D RI
.
- Répétez les étapes 2.2 à 2.4 pour mesurer les tomogrammes IR 3D de tous les sous-types de lymphocytes.
