Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut
1. Prélèvement sanguin sur les patients
ATTENTION : Prendre les mesures de sécurité appropriées en laboratoire lors du prélèvement de sang total sur le patient. Portez des gants et des lunettes. Si le patient est en isolement, veuillez suivre les procédures de niveau de biosécurité 4.
- Pour prélever du sang total intraveineux du patient, utilisez une aiguille papillon avec un tube d’extension de petit calibre et un tube à vide de prélèvement sanguin contenant un tampon de lyse/liaison. Posez le bras du patient en position descendante et positionnez le tube de prélèvement plus bas que l'aiguille papillon. Insérez l’aiguille papillon dans la veine du patient et fixez le tube à vide de prélèvement sanguin à l’extension de petit calibre.
note: Cela évitera le reflux.
- Après le prélèvement sanguin, mélangez le contenu du tube en le retournant 5 à 10 fois.
note: En raison du vide restant dans le tube de prélèvement sanguin contenant 1,6 mL de tampon de lyse/liaison, le volume de l’échantillon prélevé sera automatiquement de 1,6 mL.
- Désinfectez l’extérieur du tube avec de l’éthanol à 70 %.
- Incuber les tubes pendant 20 min à température ambiante.
note: Le protocole peut être interrompu ici et les tubes de prélèvement sanguin pleins peuvent être conservés à -20 °C, 5 °C, 25 °C ou 37 °C pendant au moins 1 mois.
- Passez directement à la méthode d’extraction NA simplifiée.
2. Extraction NA simplifiée du sang entier
- Pour purifier l’AN à partir du sang collecté inactivé par le tampon de lyse/liaison, mélangez le contenu du tube en retournant le tube à vide à la main 5 à 10 fois.
- Retirez délicatement le couvercle du tube et déchargez le couvercle.
- Verser l’aliquote préparée de MGP (1 mL) directement dans le tube de prélèvement sanguin.
- Placez un nouveau couvercle d’un tube de prélèvement sanguin non utilisé sur le tube contenant l’échantillon.
- Placez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé et mélangez le contenu du tube en retournant le tube de prélèvement sanguin à la main 5 à 10 fois.
- Placez le tube dans le support magnétique et gardez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé.
- Retournez le support magnétique avec le tube plusieurs fois à la main pour vous assurer que tous les MGP sont collectés sur le côté du tube avec l’aimant.
note: Le support magnétique peut être remplacé par un aimant allongé et un élastique.
- Retirez le couvercle du tube et jetez le contenu du tube à l’aide d’une pipette jetable ou simplement en versant le contenu dans un tube de prélèvement de 50 ml.
note: Évitez les aérosols du tube de prélèvement de 50 ml en fermant le tube avec un couvercle.
- Versez l’aliquote préparée du tampon de lavage-1 (WB-1, 4 mL) directement dans le tube de prélèvement sanguin.
- Placez le couvercle sur le tube et placez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé.
- Retirez le tube du support magnétique en maintenant le couvercle bien serré avec un doigt.
note: Si vous utilisez un aimant et un élastique, retirez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
- Remettez les MGP en suspension en retournant le tube de prélèvement sanguin à la main 5 à 10 fois.
- Répétez les étapes 2.6 et 2.8.
- Verser l’aliquote préparée de WB-2 (1,5 ml) directement dans le tube de prélèvement sanguin.
- Placez le couvercle sur le tube et retirez-le du support magnétique.
note: Si vous utilisez un aimant et un élastique, retirez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
- Placez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé.
- Remettez les MGP en suspension en retournant le tube de prélèvement sanguin pendant quelques secondes à la main.
- Répétez les étapes 2.6 et 2.8.
- Verser l’aliquote de WB-3 préparée (3 mL) directement dans le tube de prélèvement sanguin.
- Placez le couvercle sur le tube et retirez-le du support magnétique.
note: Si vous utilisez un aimant et un élastique, retirez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
- Placez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé.
- Remettez les MGP en suspension en retournant le tube de prélèvement sanguin à la main 5 à 10 fois.
- Répétez les étapes 2.6 et 2.8.
- Versez l’aliquote préparée de tampon d’élution (EB, 100 μL) directement dans le tube de prélèvement sanguin.
- Placez le couvercle sur le tube et retirez-le du support magnétique.
note: Si vous utilisez un aimant et un élastique, retirez simplement l’élastique et l’aimant du tube.
- Remettez les MGP en suspension dans l’EB en tapotant 5 à 10 fois le tube de prélèvement sanguin avec un doigt.
note: Le protocole peut être mis en pause ici, et les tubes peuvent être stockés à -20 °C.
- Transférez une gouttelette (5 à 8 μL) des MGP remis en suspension dans le mélange réactionnel d’amplification NA en aval à l’aide d’une pipette jetable de 1,5 mL (tout test d’amplification NA diagnostique en aval, tel que l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP)/LAMP à transcription inverse (RT-LAAMP) ou l’amplification en chaîne par polymérase quantitative (qPCR)/RT-qPCR peut être utilisé).
note: Les NA colleront aux MGP, alors assurez-vous d’utiliser les MGP dans la réaction d’amplification NA en aval. Mélangez la suspension MGP avant utilisation. Après le mélange, les MGP s’accumuleront au fond du tube.
