Imagerie à super-résolution de la formation de synapses immunologiques de cellules NK sur une bicouche lipidique supportée

Résumé

Source : Zheng, P., et al. Imagerie à super-résolution de la synapse immunologique des cellules tueuses naturelles sur une bicouche lipidique planaire soutenue par du verre. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente une technique permettant de visualiser la formation de la synapse immunologique dans les cellules tueuses naturelles (NK) sur une bicouche lipidique supportée (SLB). Le SLB est d’abord marqué avec un ligand du récepteur d’activation des cellules NK marqué au fluorophore, suivi d’une incubation avec des cellules NK. Par la suite, les cellules sont colorées pour des granules lytiques d’actine polymérisés et de perforine positive. Cette approche permet de visualiser la formation des synapses à l’aide de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED).

Protocole

1. Préparation des liposomes

1. Calculer la quantité de solutions mères en suspension chloroforme de biotinyle 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) et de biotinyle 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap (Biotin-PE) pour former des stocks dilués à la concentration finale souhaitée. Pour obtenir des concentrations finales de 400 μM de DOPC et de 80 μM de phospholipides de biotine-PE dans 10 ml chacun, commencez par placer 629 μl de 10 mg/ml de DOPC et 88 μl de 10 mg/ml de Biotin-PE dans des tubes de chromatographie en verre séparés.
   REMARQUE : il est important de nettoyer les seringues Hamilton en verre et les tubes de chromatographie en verre avec une solution de nettoyage (1 L d’éthanol à 95 % pour 120 ml d’eau contenant 60 g d’hydroxyde de potassium, KOH) tout en transférant une solution mère de DOPC et de Biotin-PE en suspension de chloroforme.
2. Séchez le chloroforme avec un jet d’argon dans la hotte chimique. Scellez le tube de chromatographie avec du parafilm.
3. Soumettez les liposomes nouvellement séchés à un vide poussé dans un lyophilisateur pendant la nuit (O/N) pour éliminer tout chloroforme résiduel. Pour une cuisson le jour même, sécher pendant 60 à 90 min.
4. Pendant que le lyophiliseur fonctionne, préparez un tampon de dilution. Pour ce protocole, préparez 25 ml composés de 25 mM de Tris, pH 8,0 ; 150 mM de NaCl ; et 2 % (en poids) de détergent n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG). Mélangez d’abord les deux premiers ingrédients, puis remplacez l’oxygène par de l’argon avant d’ajouter la poudre sèche OG. Après préparation, filtrez la solution OG avec une membrane d’acétate de cellulose de 0,2 micron et conservez-la à 4°C.
5. De plus, préparez deux bouteilles à vis de 1 L de tampon Tris-saline aux mêmes concentrations, mais sans OG. Placez un barreau magnétique nettoyé à l’eau distillée au fond de chacun. Préparez 6 litres supplémentaires de tampon tris-salin. Retirez l’oxygène de toutes les bouteilles contenant de l’argon et placez-les également à 4° C.
6. Après lyophilisation, dissoudre les lipides séchés dans le tampon Tris-saline OG pour obtenir une solution de 4 mM de chaque. En suivant les volumes d’exemple, ajoutez 2 ml dans le tube DOPC et 0,2 ml dans le tube Biotin-PE.
7. Mélangez les lipides de biotine-PE avec les lipides DOPC. Cela améliore la mobilité de la SLB, car la biotine couplée peut nuire à la fluidité des groupes de tête phosphate. Pour obtenir une concentration finale de 80 μM de Biotin-PE, mélanger 0,2 ml de 4 mM de Biotin-PE et 1 ml de 4 mM de DOPC. Ajoutez ensuite 8,8 ml de tampon Tris-saline OG.
8. Pour une concentration finale de 400 μM DOPC, il suffit de mélanger 1 ml de 4 mM DOPC avec 9 ml de Tris-saline OG.
9. Remplissez le sonicateur d’eau glacée. Placez le tube de verre contenant le phospholipide dilué au centre du sonicateur à l’aide d’une pince utilitaire. Sonicer le phospholipide dilué pendant 10 min jusqu’à ce que la solution devienne claire.
   note: Ajoutez de la glace dans le bain-marie du sonicateur pour maintenir la température basse car la sonication générera de la chaleur.
10. Remplissez les tubes d’argon pour déplacer l’oxygène dans l’air du liquide et scellez-les avec du parafilm.

2. Dialyse des liposomes

1. Découpez deux sections de tube de dialyse sec (poids moléculaire coupé : 12-14 000, diamètre : 6,4 mm) de longueur appropriée (dans cet exemple, 40 cm), une pour chaque dilution de phospholipides, dans le rouleau.
2. Réhydratez les sections de la tubulure en les laissant tremper dans 200 ml d’eau distillée dans un bécher en verre pendant 2 min.
3. Passez au micro-ondes pendant 5 minutes à puissance élevée, ou au moins jusqu’à ce que l’eau arrive à ébullition.
4. Faites un nœud à l’une des extrémités de chaque tube et rincez l’intérieur avec quelques millilitres de tampon Tris-saline-OG. Par la suite, essorez méticuleusement la plus grande quantité possible de ce tampon de lavage pour minimiser la quantité de tampon restant à l’intérieur.
5. Dans une hotte à flux laminaire, ajoutez les phospholipides dilués dans chaque tube et fixez les extrémités ouvertes avec une petite fermeture de tube de dialyse de manière à exclure tout air. L’exclusion complète de l’air nécessitera le sacrifice d’un petit volume de l’échantillon en le fixant sous la « ligne de flottaison ».
6. Immergez les échantillons dans les bouteilles préalablement préparées de tampon Tris-saline sans OG. Placez l’oxygène dans la bouteille avec de l’argon avant de la refermer et de la placer pour agiter O/N à 4°C.
7. Transférez le tube dans une nouvelle bouteille de tampon Tris-saline sans OG toutes les 12 h pendant au moins 3 fois.
8. Peu de temps avant l’élimination des lipides dialysés, préparez un certain nombre de petits tubes dans lesquels aliquote les lipides en les remplissant chacun d’argon pour déplacer l’oxygène.
9. Après 36 h, placez les flacons de dialyse dans la hotte à flux laminaire et retirez les tubes de dialyse des flacons. Ayez une couche de banc ou un bécher à portée de main pour recueillir le ruissellement humide.
10. Coupez le tube de dialyse au-dessus du clip, puis retirez le clip et transférez soigneusement la solution lipidique dialysée à l’aide d’une pipette dans des aliquotes de 1 ml dans des tubes pré-préparés remplis de gaz argon sur de la glace.
11. Aliquote la solution aqueuse de liposomes et utilisez le flux d’argon pour déplacer à nouveau l’oxygène dans chaque tube.
12. Stockez les liposomes à 4°C. Ne pas congeler.

3. Isolement et culture des cellules NK humaines

1. Aliquote 15 ml de sang périphérique ou de couche leucocytaire dans un tube conique de 50 ml. Diluez ce sang avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans un rapport de 1:1.
2. Ajouter doucement 13 ml de Ficoll au fond du tube à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml.
3. Centrifuger ce tube pendant 20 min à 1 200 x g avec l’accélérateur et la rupture ou à leurs réglages les plus bas.
4. Après la centrifugation, utilisez une pipette sérologique pour recueillir la couche intermédiaire blanche nuageuse flottante des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), qui doit se trouver et l’intersection entre une couche supérieure jaune clair et une couche inférieure de couleur pâle plus trouble, qui se trouvent toutes deux au-dessus d’une couche inférieure de globules rouges (GR). REMARQUE : Ne collectez pas de globules rouges lors de la collecte des PBMC.
5. Placez les PBMC collectés dans un tube conique neuf de 50 ml et diluez-les à pleine capacité avec du PBS contenant 1 % de FBS. Centrifuger à nouveau, cette fois avec le frein et l’accélérateur au maximum, pendant 5 min à 300 x g.
6. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 ml de PBS contenant 1 % de FBS.
7. Comptez les cellules pendant la centrifugation une fois de plus aux mêmes paramètres qu’à l’étape 3.6.
8. Jetez à nouveau le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu R10 à une densité de 10 millions de cellules/ml.
9. Prenez 30 millions de cellules dans un tube en polystyrène de 5 ml et isolez les cellules NK à l'aide d'un kit de séparation magnétique, en suivant les instructions du fabricant. Après l’isolement, compter les cellules une fois de plus et les remettre en suspension à une densité de 500 000 cellules/ml dans un milieu complet R10 (88 % de milieu du Roswell Park Memorial Institute, RPMI ; 10 % FBS ; 1 % d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique, HEPES ; 1 % de pyruvate de sodium) complété par de l’IL-2 (100 U/ml). Cultiver à 37° dans un incubateur de CO₂ et remplacer le milieu 2 à 3 fois par semaine.

4. Assemblage de la bicouche lipidique plane supportée par du verre

1. Préparez 100 ml de solution de piranha en mélangeant 30 % de peroxyde d’hydrogène avec de l’acide sulfurique dans un rapport de 1:3 dans un bécher.
   note: Effectuez toujours des travaux avec des agents nocifs comme l’acide sulfurique dans une hotte chimique correctement désignée.
2. Dans cette solution, immergez 2 lamelles rectangulaires #1.5 dans une solution de piranha pendant 20-30 min.
   note: Il est essentiel de nettoyer les lamelles avec une solution de piranha.
3. Pendant le nettoyage des lamelles, prélever 1 tube de lipides DOPC 400 μM préalablement préparés et 1 tube de lipides Biotin-PE 80 μM préalablement préparés. Transportez-les sur de la glace jusqu’à la cuve d’argon.
4. Déplacez l’oxygène dans un nouveau tube de microcentrifugation avec de l’argon, puis additionnez le DOPC et la Biotin-PE dans un rapport de 1:1. Le volume spécifique variera en fonction des besoins expérimentaux, mais devrait être d’au moins 2 μl chacun. Remplacez l’oxygène dans le tube de mélange avec du gaz argon, ainsi que les tubes à réactifs individuels, avant de remettre ces derniers dans le réfrigérateur.
5. Une fois le nettoyage terminé, rincez abondamment les lamelles à l’eau distillée. Faites sécher les lamelles à l’air libre pendant quelques minutes.
6. Prélever 1,5 μl du mélange de liposomes préparé à l’étape 5.4 et l’aliquote en une seule goutte dans l’une des chambres à voies de la lame de chambre. L’utilisation de 2 drops par voie est typique, mais pas nécessaire.
7. Placez rapidement et efficacement la lamelle sèche sur les gouttelettes. Assurez-vous que les gouttes sont suffisamment espacées pour qu’elles ne se confondent pas une fois la lamelle placée. De plus, assurez-vous que les gouttes restent circulaires et bien définies, sans toucher les bords des parois de la chambre. Appuyez fermement entre et autour de chaque voie pour assurer une étanchéité entre la lamelle et la glissière.
8. Marquez les positions des gouttes à l’aide d’un marqueur.
9. Passez 100 μl de caséine aqueuse à 5 % à travers la chambre pour bloquer la bicouche. Essayez de vous assurer qu’il n’y a pas de bulles dans la chambre d’écoulement.
10. Injecter 100 μl de streptavidine à une concentration de 333 ng/ml dans chaque voie. Incuber pendant 10-15 min à température ambiante (RT). Ensuite, laver en faisant passer 3 ml de solution saline tamponnée HEPES (HBS)/1 % d’albumine sérique humaine (HSA) dans chaque voie pour éliminer l’excès de streptavidine.
11. Ajouter 100 μl d’anti-CD16 biotinylé marqué par fluorescence, tel qu’Alexa Fluor 568, à la concentration protéique précédemment déterminée comme étant la plus efficace. Incuber dans l’obscurité pendant 20-30 min. Lavez à nouveau en faisant passer 3 ml de HBS/1 % HSA dans chaque voie.
12. Faites circuler 100 μl de D-biotine à une concentration de 25 nM à travers la chambre afin de lier tout excès de streptavidine et ainsi éliminer le risque de liaison non spécifique de la streptavidine aux cellules.
13. Compter les cellules NK et les remettre en suspension à une concentration de 500 000/ml dans HBS/1 % HSA.
14. Pendant que les cellules sont en rotation, lavez la D-biotine hors de la chambre avec 3 ml supplémentaires de HBS/1 % HSA par voie.
15. Vérifiez la mobilité des ligands sur la SLB par récupération de fluorescence après photoblanchiment (récupération de fluorescence après photoblanchiment, FRAP) sur une fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) ou une microscopie confocale avant d’ajouter des cellules NK.
16. Une fois que les cellules ont fini de tourner et ont été remises en suspension à la concentration souhaitée, ajoutez 100 μl à chaque voie.
17. Placez la chambre dans un incubateur à 37° 5 % de CO₂ pendant 30-60 min.
18. Après cette période d’incubation, fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde à RT pendant 10 à 20 min. Lavez en faisant passer 3 ml de PBS dans chaque voie pour éliminer le paraformaldéhyde.
19. Ajouter 400 μl de tampon bloquant (5 % de sérum d’âne normal et 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS). Incuber à RT pendant 30 min.
20. Colorez l’actine F et la perforine en ajoutant 200 μl de phalloïdine diluée marquée par fluorescence (1 unité/ml de phalloïdine marquée) et d’anticorps monoclonal anti-perforine marqué par fluorescence (500 ng/ml d’anticorps monoclonal anti-perforine). Incubation à RT pendant 1 heure.
21. Laver en faisant couler 3 ml de PBS. La chambre est prête pour l’imagerie.

5. Imagerie de la synapse NK sur une bicouche lipidique à l’aide de STED

1. Allumez tous les modules matériels nécessaires.
2. Démarrez le logiciel d’analyse d’images. Activez à la fois les modules de balayage résonant et STED. Après avoir effectué ces sélections, attendez environ 3 à 5 minutes pour que le logiciel se lance.
3. Cliquez sur l’onglet « Configuration » en haut de l’écran.
4. Sélectionnez « Configuration laser », puis allumez la lumière blanche et les lasers STED 592 nm.
5. Choisissez l’objectif 100x et alignez le faisceau laser d’excitation avec le laser d’appauvrissement de 592 nm.
6. Sélectionnez le module « Laser Config », désactivez le laser d’épuisement 592 et allumez le laser d’épuisement 660 nm.
7. Placez la diapositive sur la scène, au-dessus de l’objectif. Mettez au point les cellules liées à la région bicouche délimitée à l’aide de la lampe à lumière blanche et des oculaires.
8. Retournez à l’onglet « Acquisition », directement à droite de l’onglet « Configuration ».
9. Cliquez sur l’onglet « Passer à la lumière blanche », puis allumez ce module et faites glisser la ligne laser d’excitation sur la longueur d’onde appropriée.
10. Sélectionnez le détecteur souhaité dans la liste de ceux disponibles, puis définissez la plage de détection pour englober la plage de longueurs d’onde appropriée.
    note: NE JAMAIS placer la portée de détection directement sous le faisceau d’excitation.
11. Cliquez sur le bouton « Séquentiel » dans la barre d’outils « Acquérir » de gauche pour faire apparaître la boîte de dialogue Analyse séquentielle en bas de la barre d’outils de gauche. Cela permet à l’utilisateur d’ajouter plusieurs séquences, chacune avec un faisceau d’excitation différent pour une couleur différente. Cliquez sur « Entre les images », puis définissez la fréquence d’excitation, le détecteur et la plage de détection pour chaque couleur supplémentaire comme aux étapes 5.9 et 5.10.
12. Une fois tous les paramètres optimisés, appuyez sur « Démarrer » pour commencer le processus d’acquisition.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine	Avanti	Référence 850375C	Préparation des liposomes
Bouchon Biotinyl 18:1 PE 1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(cap biotinyl) (sel de sodium)	Avanti	Référence 870273C	Préparation des liposomes
Gaz argon comprimé	Gaz à air	UN1006	Préparation des liposomes
Un lyophilisateur	Labconco	Zone Libre 7740020	Préparation des liposomes
Tubes lyophilisateurs	Labconco	Référence 7540200	Préparation des liposomes
Colonnes de chromatographie	Santa Cruz	SC-205558	Préparation des liposomes
1 M Tris pH 8,0	Ambion	AM9856	Préparation des liposomes
5 M NaCl	Ambion	AM9759	Préparation des liposomes
Octyl-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	O1008	Préparation des liposomes
Tubulure de dialyse	Laboratoires Spectrum	132676	Préparation des liposomes
Plaque de polystyrène à fond en V de 96 puits (non traitée)	Corning	Référence 3896	Détermination de la densité des anticorps
Billes de silice non fonctionnalisées	Laboratoires Bangs	SS06N	Détermination de la densité des anticorps
Tubes FACS	Fisher Scientific	Référence 14-959-2A	Détermination de la densité des anticorps
Perles QuantumTM MESF	Laboratoires Bangs	variable	Détermination de la densité des anticorps
caséine	Sigma-Aldrich	Réf. C0875	Préparation de bicouches lipidiques
SALINE tamponnée HEPES + 1 % HSA	fait maison		Préparation de bicouches lipidiques
Streptavidine	Technologies du vivant	434301	Préparation de bicouches lipidiques
Protéine biotinylée marquée par fluorescence	fait maison		Préparation de bicouches lipidiques
ibidi Sticky-Slide VI 0.4	Ibidi	Référence 80608	Préparation de bicouches lipidiques
Lamelle en verre 25x75 mm	Ibidi	Référence 10812	Préparation de bicouches lipidiques
Peroxyde d’hydrogène (30 %)	Fisher Scientic	BP2633	Préparation de bicouches lipidiques
acide sulfurique	Sigma-Aldrich	258105	Préparation de bicouches lipidiques
D-Biotine	Invitrogen	Réf. B20656	Préparation de bicouches lipidiques
Papier pour verres	VWR	Référence 54826-001	Pour l’imagerie
Huile d’immersion de type F	Leica	Tél. : 11 513 859	Pour l’imagerie
Un microscope Leica TCS STED	Leica		Pour l’imagerie