Préparation d’un échantillon pour un test de cytotoxicité à médiation cellulaire tueuse naturelle pour l’analyse cytométrique en flux

Résumé

Source : McBride, J. E., et al. de l’activité lytique des cellules tueuses naturelles dans le sang total humain. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo démontre l’activité lytique des cellules tueuses naturelles contre les cellules cibles colorées par fluorescence. La méthode permet de mesurer la cytotoxicité induite par les cellules NK en colorant les cellules mortes et en utilisant un cytomètre en flux pour quantifier les cellules cibles vivantes et mortes.

Protocole

1. Préparation des contrôles

1. Transférez les éléments suivants dans des tubes de 1,5 ml séparés et étiquetés de manière appropriée :
   1. Ajouter 500 μL d’IMDM frais contenant des cellules K562 marquées au DiO en suspension dans le tube de 1,5 mL étiqueté « Double Positif ».
   2. Ajouter 500 μL d’IMDM frais contenant des cellules K562 marquées au DiO en suspension dans le tube de 1,5 mL étiqueté « DiO uniquement ».
   3. Ajouter 500 μL d’IMDM frais contenant des cellules K562 non marquées en suspension dans le tube de 1,5 mL étiqueté « Iodure de propidium (IP) uniquement ».
2. Placez les tubes Double Positif et PI uniquement dans un bain-marie à 55 °C pendant 5 min.
3. Une fois les 5 minutes écoulées, retirez les tubes et essuyez-les avec de l’éthanol à 70 %.
4. Ajoutez 10 L de PI dans les tubes Double Positif et PI seulement 1,5 ml.
5. Placez les trois cellules cibles de contrôle K562 dans l’incubateur à 37 °C pendant 30 min.
6. Une fois l’incubation de 30 minutes écoulée, centrifugez les trois cellules cibles témoins de K562 pendant 2 minutes à 163 x g.
7. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
8. Remettre chaque témoin en suspension avec 20 μL de milieu de culture cellulaire IMDM frais et laisser dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant au moins 30 min pour un signal DiO optimal.
   note: Les commandes sont maintenant prêtes à être exécutées dans le cytomètre en flux d’imagerie.

2. Préparation de l’échantillon de test de cytotoxicité

1. Préparez et étiquetez des tubes de 1,5 mL pour chaque échantillon/participant en conséquence.
2. La pipette souhaitait connaître le rapport entre les cellules NK et les cellules K562 marquées au DiO dans chaque tube.
   REMARQUE : Par exemple, le rapport souhaité entre les cellules cibles K562 et les cellules effectrices NK est de 1:5.
3. Centrifugeuse pendant 5 min à 135 x g.
4. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
5. Mettre en suspension un mélange de cellules K562 marqué au NK-DiO dans 500 μL de milieux cellulaires NK sans interleukine-2 (IL-2) et 2-mercaptoéthanol (2-ME) (milieux de culture de cellules NK incomplets).
   REMARQUE : Le milieu de culture cellulaire NK incomplet est Minimum Essential Medium Eagle avec bicarbonate de sodium, sans L-glutamine, ribonucléosides et désoxyribonucléosides.
6. Ajouter 5 μL de PI dans chaque tube.
7. Centrifuger pendant 2 min à 163 x g.
8. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 h.
9. Après 2 h d’incubation, centrifuger pendant 2 min à 163 x g.
10. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
11. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture de cellules NK incomplet de 25 μL.

3. Préparation de l’échantillon spontané (« S »)

1. Pipeter 500 μl de cellules K562 marquées au DiO (concentration de 1 x 106 cellules/mL) dans un tube de 1,5 mL.
2. Ajouter 10 μL de PI dans chaque tube.
3. Tube de centrifugation pendant 2 min à 163 x g.
4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 h.
5. Après 2 h d’incubation, centrifuger pendant 2 min à 163 x g.
6. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire.
7. Remettre les cellules en suspension dans des milieux de culture cellulaire alpha-minimum incomplets de 25 μl α-MEM).

4. Acquisition de données avec cytomètre en flux d’imagerie

1. Appuyez sur le bouton vert à l’intérieur de la porte avant du cytomètre de flux d’imagerie pour allumer l’instrument.
2. Allumez tous les ordinateurs associés au cytomètre de flux d’imagerie.
3. Lancez le logiciel d’imagerie du cytomètre en flux.
4. Cliquez sur le bouton « Démarrage » pour vider le système et préparer la ligne d’échantillonnage.
5. Une fois le « Démarrage » terminé, fermez la fenêtre « Calibrages ».
6. Attribuer des canaux : en haut à gauche, cliquez sur chaque canal afin de les attribuer.
7. Sur le côté droit, cliquez sur le bouton du nuage de points pour créer 4 nuages de points : Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 et FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
8. Commencez l’analyse des échantillons en utilisant d’abord la commande « Double Positif ».
   1. Cliquez sur « Charger ».
   2. Placez le tube de 1,5 ml contenant l’échantillon « Double Positif » des étapes 1.4 à 1.8 dans le chargeur d’échantillons.
   3. Sélectionnez l’objectif 40X sous l’onglet « Grossissement ».
   4. Allumez les lasers de 405 mW et 642 mW.
   5. Activez la chaîne « Fond clair ».
   6. Cliquez sur « Sélectionner l’intensité ».
   7. Sur la base de l’échantillon de contrôle « Double Positif », déterminez l’intensité souhaitée pour le laser de 405 mW afin que le détecteur ne soit pas surchargé.
      note: Par exemple, l’intensité optimale de cette expérience a été fixée à 11 mW.
9. Une fois la configuration souhaitée terminée, acquérez des données.
   1. Sous l’onglet « Acquisition de fichiers », entrez le texte d’un nom de fichier personnalisé. Sélectionnez un dossier pour enregistrer le(s) fichier(s) de données.
   2. Entrez le nombre de cellules à acquérir à côté de « Collecter ». En général, ce nombre varie entre 1 000 et 10 000.
   3. Cliquez sur « Acquérir."
      REMARQUE : Une fois que le nombre de cellules souhaité est acquis, le fichier de données est automatiquement enregistré dans le dossier précédemment sélectionné.
10. Une fois l’acquisition terminée, chargez l’échantillon de contrôle suivant – contrôle DiO uniquement.
    1. Cliquez sur « Charger ».
    2. Placez le tube de 1,5 mL contenant l’échantillon « DiO only » dans le chargeur d’échantillons.
    3. Laissez l’objectif 40X sous l’onglet « Grossissement » sélectionné.
    4. Laissez le laser de 405 mW allumé.
    5. Éteignez le laser de 642 mW et le canal « Brightfield ».
       REMARQUE : Maintenant que la configuration souhaitée a été réalisée, les données peuvent être acquises.
    6. Sous l’onglet « Acquisition de fichiers », entrez le texte d’un nom de fichier personnalisé et sélectionnez un dossier pour enregistrer le ou les fichiers de données. Entrez le nombre de cellules à acquérir à côté de « Collect. ». En général, ce nombre est de 1 000.
    7. Cliquez sur « Acquérir."
       note: Une fois le nombre de cellules souhaité obtenu, le fichier de données est automatiquement enregistré dans le dossier précédemment sélectionné.
11. Répétez l’étape 4.10 pour l’échantillon de contrôle « PI uniquement ». Les échantillons expérimentaux sont maintenant prêts à être collectés.
12. Manipulez les échantillons expérimentaux restants, y compris les échantillons spontanés en « S » comme suit :
    1. Laissez l’objectif 40X sous l’onglet « Grossissement » sélectionné.
    2. Allumez les lasers de 405 mW et 642 mW.
    3. Activez la chaîne « Fond clair ».
    4. Cliquez sur « Régler l’intensité ».
    5. Sous l’onglet « Acquisition de fichiers », entrez le texte d’un nom de fichier personnalisé et sélectionnez un dossier pour enregistrer le ou les fichiers de données. Entrez un texte de nom de fichier personnalisé.
    6. Entrez le nombre de cellules à acquérir à côté de « Collecter ».
    7. Cliquez sur le bouton « Acquérir ».
       note: Une fois le nombre de cellules souhaité obtenu, le fichier de données est automatiquement enregistré dans le dossier précédemment sélectionné.
13. Répétez l’étape 4.12 pour tous les échantillons expérimentaux.
14. Une fois que toutes les données et tous les fichiers expérimentaux ont été collectés, cliquez sur le bouton « Arrêter » pour stériliser le système.

5. Analyse d’échantillons de cytomètre de flux d’imagerie

1. Ouvrez l’application logicielle d’analyse de cytomètre en flux.
2. Sous « Fichier », ouvrez une expérience . RIF.
3. Créez une nouvelle matrice à l’aide d’une seule couleur. RIF (contrôle DiO uniquement et contrôle PI uniquement, créés lors des étapes 4.10 et 4.11) en sélectionnant « Créer une nouvelle matrice » sous l’onglet Compensation du logiciel de cytomètre en flux d’imagerie.
   REMARQUE : Le logiciel demandera la sélection des fichiers de couleur unique et les fusionnera pour créer un fichier matriciel (extension de fichier .ctm), qui doit être sélectionné pour appliquer une compensation de canal.
4. Créez des diagrammes à points à l’aide de la fonction « Building Blocks » du logiciel.
   1. Créez un graphique à points (BrightFieldGradient_RMS en fonction de la fréquence) pour bloquer les cellules focalisées. Appelez la porte « Focus » (Figure 1A).
   2. À l’aide de la porte « Focus », créez un diagramme à points de la zone en champ clair par rapport au rapport hauteur/largeur en champ clair pour contrôler les cellules singulet. Appelez la porte « Simple » (Figure 1B).
   3. À l’aide de la porte « Unique », créez un diagramme à points de Intensity_MC_Ch02 en Intensity_MC_Ch5. Utilisez ce graphique pour identifier et contrôler uniquement les cellules DiO-positives (cibles, vivantes) et les cellules PI-DiO doublement positives (cibles, mortes) (Figure 1C).
      note: Tous les tracés décrits aux étapes 5.4.1, 5.4.2 et 5.4.3 peuvent être créés à l’aide de la fonction « blocs de construction » du logiciel.
5. Cliquez sur la fonction statistiques du graphique à points pour accéder aux numéros de cellule de chaque porte.
6. Calculez le pourcentage de cibles mortes dans l’échantillon spontané et les échantillons expérimentaux à l’aide de la formule suivante :
   % de cibles mortes dans l’échantillon = (#dead cibles x 100)/(#live cibles + #dead cibles)
7. Calculer la cytotoxicité à l’aide de la formule suivante :
   % de cytotoxicité = [(Mort expérimental-Mort spontané)/(100-Mort spontané)]x100

Résultats

Figure 1 : Histogrammes représentatifs, nuages de points et images pour l’analyse de l’activité cytotoxique. (A) analyse de cellules focales. (B) l’analyse de cellules uniques. (C) l’analyse de la coloration des cellules cibles. Toutes les déterminations sont faites à l’aide de l’image jointe à chaque événement. Il est possible d’y accéder dan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lymphoblastes K-562	ATCC	CCL-243
Le support modifié de Dulbecco par Iscove	ATCC	30-2005	Glycémie élevée, avec L-Glutamine, avec HEPES, Filtré stérilement
Alpha Minimum Média essentiel	ATCC	CRL-2407	Sans ribonucléosides ni désoxyribonucléosides mais avec 2 mM de L-glutamine et 1,5 g/L de bicarbonate de sodium
Solution de coloration à l’iodure Propridium	BD Pharmingen	Référence 51-66211E
Solution de marquage cellulaire Vybranto DiO	Vybranto	Réf. V-22886
ImageStream X Mark II Cytomètre de flux d’imagerie
Microbilles CD56 de sang total, humain	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-090-875
ImageStream X Mark II Cytomètre de flux d’imagerie	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	Réf. 400030
Logiciel INSPIRE	EMD Millipore	Version Mark II, septembre 2013
Idées Logiciel d’application	EMD Millipore		Version 6.1, juillet 2014