Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut
1. Préparation générale des PCLS humains et exposition ultérieure aux produits chimiques
REMARQUE : Deux personnes sont nécessaires pour remplir un poumon. Il est recommandé de disposer d’un carnet de vaccination à jour contre les hépatites A et B. Les patients subissent régulièrement un dépistage du VHC et du VIH avant la transplantation pulmonaire. Si une infection active à Mycobacterium tuberculosis est diagnostiquée ou suspectée, le poumon doit être rejeté. Néanmoins, tous les tissus pulmonaires humains frais et les échantillons qui en sont issus doivent être traités comme potentiellement infectieux et des mesures de protection correspondantes doivent être prises (masques à filtre à particules (FFP2), lunettes de protection, gants) pour assurer la sécurité au travail du personnel. La procédure dure 60 à 90 min.
- Confirmer l’intégrité du lobe pulmonaire humain.
note: Une déchirure de la plèvre empêche un remplissage homogène du tissu. Le matériel pulmonaire humain doit provenir du jour de la résection. Des périodes de stockage d’environ 2 h à température ambiante (RT) avant de le remplir d’agarose sur glace sont tolérées. Le tissu que nous utilisons dans ce protocole est obtenu auprès de patients subissant une résection. Il ne s’agit pas de patients décédés. Si le tissu a été stocké sur de la glace, préchauffez-le à RT avant de le remplir, sinon l’agarose polymérisera immédiatement, et aucun remplissage homogène ne sera possible.
prudence: Assurez-vous que toutes les personnes en contact avec du matériel humain autochtone portent des vêtements de protection composés d’une blouse de laboratoire, de deux paires de gants, d’une casquette, d’un masque facial et d’une paire de lunettes de sécurité. Le matériel humain est potentiellement infectieux.
- Pesez 7,5 g d’agarose peu gélifiant et ajoutez-le à 250 ml d’eau bidistillée. Faites bouillir l’agarose au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit dissous. Refroidissez-le à environ 40 °C, en fonction du point de fusion et de gélification de l’agarose.
note: Plusieurs flacons sont nécessaires, en fonction de la taille des lobes.
- Préchauffer et maintenir le milieu de culture (table des matières) à 37 °C.
note: Si l’agarose est trop chaude, les vitamines dans le milieu de culture perdront de leur efficacité et les cellules seront endommagées. Si la température de la solution de milieu/agarose est inférieure à 37 °C, le processus de gélification commencera et nuira au remplissage homogène du poumon. Seule une plage de température de 37 °C à 39 °C est recommandée.
- Mettez tout le matériel nécessaire à portée de main avant de commencer : 5 à 10 pinces, un cathéter flexible d’environ 1 m de long, une seringue appropriée (par exemple, 50 ml) adaptant le raccord au cathéter et une glacière remplie de glace.
- Canulez la trachée/bronche principale en insérant le tube en silicone et en le fixant à l’aide d’une pince orientée parallèlement au tube, de sorte que la pince comprime le tissu le long du tube en silicone sans le pincer. Vérifiez que le tube en silicone est fixé à l’intérieur et ne peut pas glisser pendant la procédure de remplissage. Fermez toutes les autres bronches, vaisseaux sanguins et blessures à l’aide de pinces, afin qu’aucune agarose ne puisse s’échapper pendant la procédure de remplissage.
- Mélanger un volume équivalent de 3 % d’agarose faiblement gélifiante avec un milieu de culture dans un bécher. Instiller le mélange dans les poumons à l’aide d’une seringue de 50 ml. Avant de remplir la seringue avec du fluide, fermez le cathéter avec les doigts ou une pince pour éviter les bulles d’air et le reflux d’agarose. Remplissez le lobe pulmonaire jusqu’à ce qu’il soit complètement gonflé. Touchez soigneusement la plèvre pulmonaire sur le côté ; La plèvre doit être régulière et dure.
note: Selon la taille du lobe pulmonaire, jusqu’à 2 ou 3 L de solution d’agarose/milieu peuvent être nécessaires.
- Répétez les étapes 1.5 et 1.6 pour chaque bronche dans le cas de plusieurs bronches au sein d’un même échantillon.
- Mettez le poumon sur de la glace pour la polymérisation de l’agarose en gel pendant 20 à 40 min, selon la quantité d’agarose instillée. Touchez soigneusement la plèvre sur plusieurs côtés pour vérifier si elle est dure et froide, indiquant que la polymérisation est terminée, sinon, continuez à attendre. Les pathologistes couperont le poumon en tranches, prélèveront leurs échantillons et stockeront le matériel pulmonaire sur de la glace pour le transport.
- Coupez le tissu pulmonaire humain en tranches de 3 à 5 cm à l’aide d’un couteau bien aiguisé.
note: Utilisez une nouvelle lame pour chaque poumon pour assurer la netteté.
- Remplissez la trancheuse à mouchoirs avec 400 ml de solution saline équilibrée (EBSS) glacée d'Earle's. Découpez immédiatement des carottes de tissu cylindriques dans les dalles pulmonaires à l’aide d’un tournevis semi-automatique avec un outil de carottage du diamètre souhaité (par exemple, 8 mm ; 10 mm).
REMARQUE : Ce diamètre doit être équivalent au diamètre du porte-mouchoir à l’intérieur de la machine.
- Ajustez l’épaisseur des tranches de poumon à la valeur d’épaisseur souhaitée.
note: Une épaisseur d’environ 250 μm est couramment utilisée dans les expériences PCLS. Le fabricant de la trancheuse à tissus recommande sa jauge d’épaisseur de tranche de tissu pour la vérification de l’épaisseur de la tranche. Alternativement, la coloration à montage entier combinée à la microscopie confocale peut être utilisée pour déterminer l’épaisseur de la tranche, comme décrit par Brismar et al.27
- Transférez les carottes de tissu dans le support de tissu de la trancheuse de tissus. Placez le poids (partie du porte-tissus) sur le tronc du tissu. Réglez la vitesse du bras et la vitesse de la lame sur 6 sur la trancheuse à tissus. Commencez à trancher le noyau tissulaire en PCLS.
- Supplément de 500 mL de milieu modifié Dulbecco's Eagle (DMEM) disponible dans le commerce : mélange nutritif F-12 DMEM/F12 (1:1) avec 5 mL de pénicilline (10 000 unités/mL) et de streptomycine (10 000 μg/mL). Conservez le milieu de culture pendant plusieurs jours dans des conditions stériles au réfrigérateur. Préchauffez uniquement le volume requis du medium.
note: La pénicilline sera inactivée si elle est maintenue à 37 °C pendant de longues périodes. Utilisez un milieu de culture sans sérum et sans colorant, car la composition du sérum varie d’un lot à l’autre et les colorants, tels que le rouge phénolique, peuvent interférer avec les dosages.
- Remplissez une boîte de Pétri (100 x 15 mm) avec 25 ml de milieu de culture glacé. Le fluide doit être évacué de la trancheuse à tissus dans un bécher en ouvrant la pince du cylindre en verre. Transférez les tranches d’un bécher dans la boîte de Pétri avec le milieu de culture à l’aide d’un applicateur (p. ex., boucle d’inoculation). Mettez la boîte de Pétri dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2, 100 % d’humidité). Laissez le milieu se réchauffer avant les étapes de lavage.
note: Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles.
- Placez une passoire cellulaire dans la boîte de Pétri pour laver le PCLS. Retirer complètement le milieu de culture à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL à travers la passoire cellulaire et ajouter 25 mL de milieu frais préchauffé à 37 °C. Répétez cette étape 3 à 4 fois toutes les 30 min.
note: La passoire à cellules empêche les tranches d’être aspirées dans la pipette, afin d’éviter d’endommager les tranches.
- Transférez soigneusement les tranches de poumon dans une plaque de culture à 24 puits avec un milieu de culture d’au moins 500 μL pour deux tranches par puits. Exposer le tissu pulmonaire à des substances (voir étapes 3.1 à 3.4), par exemple pendant 24 h à 37 °C, 5 % CO2,
note: Pour le transfert, utilisez de préférence une boucle d’inoculation et laissez les tranches flotter sur la boucle afin d’éviter d’endommager les tissus. Il n’est pas nécessaire de séparer davantage les tranches, car seul un manque de milieu frais suffisant induira la mort cellulaire dans les coupes de tissu. Les tranches peuvent se chevaucher ou se toucher dans le puits : cela n’a aucune influence sur la viabilité des tissus.
- Mettez toutes les matières humaines résiduelles dans un flacon en plastique avec un fixateur (p. ex., formaldéhyde tamponné à 10 %) pendant au moins 24 heures et brûlez-le pendant le processus d’élimination.
Attention : Le formaldéhyde est toxique, effectuez cette étape sous une cagoule.
2. Préparation des solutions pour les substances
REMARQUE : Préparez les solutions de travail et les commandes immédiatement avant utilisation.
Attention : Manipulez les substances conformément aux consignes de sécurité ou, si elles ne sont pas connues, comme potentiellement dangereuses et suivez les précautions de sécurité habituelles.
- Dissoudre les substances hydrosolubles directement dans le milieu de culture. Pour les produits chimiques insolubles ou peu solubles, dissolvez d’abord la substance dans les solvants appropriés en fonction de la solubilité de la substance. Les substances dont la solubilité dans l’eau est limitée (<0,1 mg/mL) peuvent être dissoutes, par exemple, dans du DMSO ou de l’éthanol. Les concentrations de solvants non toxiques doivent être déterminées au préalable par titrage. Assurez-vous que les substances ne précipitent pas hors de la solution lorsqu’elles sont diluées dans le milieu.
note: Des solutions de HClPt et de laureth sulfate de sodium (SLS) sont préparées.
- Préparez des solutions mères de substance à 100 fois la concentration la plus élevée souhaitée dans le milieu de culture ou le solvant. Peser 12,5 mg de HClPt et 34,4 mg de SLS et préparer des solutions mères en dissolvant les produits chimiques dans un milieu de culture de 1 mL.
note: Aucun solvant n’est requis pour ces produits chimiques.
- Préparez une dilution finale de 1:100 dans un milieu préchauffé. Dans le cas d’une utilisation antérieure d’un solvant, cette approche permet d’obtenir la même concentration finale de solvant pour toutes les concentrations de substance.
- Utiliser la concentration finale de solvant (p. ex., 1 %, comme décrit à l’étape 2.3) pour le traitement de référence du PCLS. Aucun contrôle des solvants n’a été requis pour les produits chimiques mentionnés dans la section des résultats.
3. Références positives et négatives pour les tests de cytotoxicité
- Pour tous les essais de viabilité, préparer les témoins positifs et négatifs suivants :
- Contrôle tissulaire : incuber le PCLS dans un milieu de culture uniquement comme référence pour le PCLS non traité pendant 24 h dans des conditions de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2, 100 % d’humidité).
- Contrôle du véhicule (si nécessaire) : incuber le PCLS avec la concentration finale de solvant comme référence pour le PCLS traité avec un véhicule seul (voir étape 1.4) pendant 24 h dans des conditions de culture cellulaire (37 °C, 5 % de CO2, 100 % d’humidité).
- Contrôle positif : incuber PCLS avec 1 % de détergent dans une solution tampon pendant 1 h à 4 °C.
note: Si le PCLS devient incolore, le tissu est mort. La L-lactate déshydrogénase (LDH) totale est déterminée dans le surnageant, avec une absorption d’environ 1,9 à 2,3 (voir étapes 4.1 à 4.4).
4. Dosage de la LDH
Remarque : Le dosage de la LDH est effectué dans une plaque de 96 puits avec 100 μL de surnageant de culture au total après la période de post-incubation.
- Après l’incubation du PCLS avec ou sans les agents d’essai, prélever 50 μL de surnageant de l’étape 1.16 et le transférer en deux exemplaires dans une nouvelle plaque à 96 puits. Cela génère des doublons à partir de chaque puits traité d’une plaque de 24 puits.
- Préparez la solution de travail du réactif LDH immédiatement avant le dosage. La solution de travail se compose de la solution catalytique (lyophilisat dissous dans 1 mL d’eau bidistillée) et de la solution colorante fournie par le fabricant. Pour une plaque à 96 puits, mélangez soigneusement 125 μL de solution catalytique avec 6,25 ml de solution de colorant.
prudence: N’exposez pas la solution à la lumière directe.
- Pipeter 50 μL de la solution de travail dans chaque puits contenant déjà 50 μL de surnageant et incuber la plaque pendant 20 min à RT dans l’obscurité. Aucun autre mélange n’est nécessaire.
- Mesurer l’absorption de chaque puits à 492 nm (référence : 630 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques. Soustrayez l’absorption à 630 nm de 492 nm. Ces valeurs seront utilisées pour le calcul à l’étape 3.5.
note: Des données fiables pour l’évaluation de la cytotoxicité ne peuvent être obtenues qu’à partir de tissus viables. L’absorption du témoin traité au détergent doit être supérieure à 1.
- Pour l’analyse, fixer la valeur d’absorption du témoin positif de l’étape 2.1 à 100 % et calculer la libération de LDH dans les échantillons traités par rapport au témoin positif (c’est-à-dire la libération maximale de LDH).