1. Préparation du milieu splénocytaire et du tampon de cytométrie en flux
- Effectuez toutes les étapes sous une hotte biologique nettoyée à 70 % d’éthanol.
- Retirer 70 ml de milieu préchauffé du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (disponible dans le commerce et fourni dans des flacons stériles filtrés de 500 ml) et placer dans un tube stérile. Le support supprimé sera utilisé ultérieurement dans le protocole.
- Compléter les 430 ml restants de RPMI 1640 1x avec 50 ml de sérum fœtal bovin inactivé (FBS), 5 mL de pénicilline/streptomycine, 5 mL d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES), 5 ml d’acides aminés non essentiels, 5 mL de pyruvate de sodium et 0,05 mL de 2-mercaptoéthanol.
note: Préchauffer le milieu splénocytaire à l’aide d’un bain-marie réglé à 37 ºC pour éviter de choquer les cellules par la chaleur. Ceci est important pour éviter l’induction de l’apoptose cellulaire.
- Pour préparer le tampon de cytométrie en flux, ajoutez 2 ml de FBS à 98 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conservez-la au réfrigérateur jusqu’à l’utilisation (de préférence dans les trois jours).
2. Génération de suspension de cellules splénocytaires à partir de rates de sourisNur77 GFP
- Isoler aseptiquement la rate d’une souris femelle Nur77GFP âgée de 6 à 8 semaines.
- Pour ce faire, travaillez sous une cagoule stérile. Trempez la fourrure de souris sacrifiée, les ciseaux et les pinces dans de l’éthanol à 70 %.
- Posez la souris sur son côté droit et coupez la peau et les muscles du quadrant abdominal supérieur gauche. Inspectez la zone d’incision pour localiser visiblement la rate, puis coupez-la. Conservez la rate dans un milieu splénocytaire sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à effectuer l’étape suivante.
- Placez la rate dans une boîte de Pétri deculture cellulaire de 10 cm contenant 5 ml de milieu splénocytaire préchauffé.
- Écrasez la rate à l’aide d’un piston de seringue stérile jusqu’à ce que la solution soit trouble. Une matrice de collagène de la rate doit rester à la fin de la procédure.
- Après un brassage intensif dans un milieu splénocytaire, recueillir la suspension cellulaire et la passer dans une crépine cellulaire de 70 μm placée sur un tube de 50 ml pour filtrer tout débris ou caillot.
- Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille cellulaire en suspension dans 2 à 3 ml de tampon de lyse des globules rouges produit en interne ou commercial. Après le pipetage (2-3 fois), laissez reposer la suspension pendant 20-30 s.
- Ajouter 5 mL de PBS ou un tampon approprié de votre choix, puis centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 500 x g.
- Retirez le surnageant (qui doit être de couleur rouge car il contient des globules rouges lysés) et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans 2 ml de milieu splénocytaire.
- À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules colorées au bleu trypan pour différencier les cellules vivantes et mortes (nécrotiques).
3. Isolement des lymphocytes T à partir de la suspension de cellules splénocytaires
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 500 x g. Remettre les cellules en suspension dans un milieu RPMI sans sérum (50 ml à partir de l’étape 1.3) pour obtenir une concentration cellulaire de 10 x 106 cellules/mL.
- Transférez les cellules dans un tube de polystyrène de 5 ml et mettez de côté une aliquote de 100 μL de splénocytes pour l’évaluation ou la comparaison de la pureté à la fin de l’étape de purification.
- Ajouter du sérum de rat normal à la suspension cellulaire à 50 μL/mL, suivi d’un cocktail d’anticorps d’isolement des lymphocytes T (50 μL/mL).
- Mélangez la suspension cellulaire et laissez-la reposer pendant 10 min. Cette étape permet au cocktail d’anticorps de se lier à toutes les cellules indésirables.
- Ajouter les sphères rapides de streptavidine (billes magnétiques) pendant 2,5 min, puis porter le volume à 2,5 mL à l’aide du milieu sans sérum.
- Placez le tube dans un aimant d’isolement de cellule pendant 3 min.
- Transférez la suspension de cellules T dans un nouveau tube de polystyrène en tenant l’aimant et en versant la solution en un seul mouvement.
note: La suspension isolée contient les lymphocytes T purifiés. Toutes les cellules indésirables sont maintenues sur le côté du tube lié aux billes magnétiques de streptavidine.
- Comptez les lymphocytes T isolés à l’aide de trypan blue et d’un hémocytomètre.
note: À cette étape, la pureté des lymphocytes T isolés peut être vérifiée (facultatif) en analysant le pourcentage d’événements CD3+ avant et après l’isolement des lymphocytes T par cytométrie en flux.
- En bref, centrifuger 1 ml de suspension de cellules splénocytaires à 500 x g. Jeter le surnageant et suspendre les cellules dans un tampon de cytométrie en flux à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Ajouter un anticorps anti-souris CD3 marqué par fluorescence à une concentration de 1:100. Incuber à 4 °C pendant 30 min. Laver une fois, centrifuger et remettre en suspension dans un tampon de cytométrie en flux (400 μL) pour analyse par cytométrie en flux.
4. Activation des lymphocytes T et induction de l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP)
- Ensemencez les lymphocytes T, en suspension, dans une plaque à fond rond de 96 puits à une concentration de 2,5 x 105 cellules/puits.
- Ajouter de l’interleukine (IL)-7 recombinante à 2 ng/mL et des billes magnétiques CD3/CD28 (25 μL/106 cellules). Gardez une partie des lymphocytes T non traitée avec des billes pour servir de contrôle négatif pour les mesures ultérieures qui représentent des lymphocytes T non activés.
- Douze heures plus tard, récoltez les lymphocytes T de la plaque de 96 puits en pipetant doucement la suspension cellulaire dans chaque puits de haut en bas pour briser tout complexe ou agrégat de cellules de billes. Recueillir la suspension de tous les puits dans un tube de polystyrène de 5 ml.
- Placez le tube contenant la suspension à l’intérieur du même aimant d’isolement cellulaire que celui utilisé précédemment pour la purification des cellules T et laissez-le reposer pendant 5 min.
- Transférez la suspension de cellules T dans un nouveau tube de polystyrène en tenant l’aimant et en versant la solution en un seul mouvement.
- Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min. Suspendez à nouveau les cellules dans un milieu splénocytaire frais pour obtenir une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
- Évaluer l’intensité de l’expression de la GFP par cytométrie en flux (facultative pour le contrôle de la qualité) 12 à 24 h après la stimulation par rapport aux lymphocytes T non activés. 12
note: La fluorescence de la GFP est intrinsèque aux cellulesT GFP de Nur77 et se manifeste lors de l’activation réussie du récepteur des cellules T, TCR.
- Pour l’évaluation de la viabilité et de l’activation (facultatif) par microscopie, colorer les cellules activées avec Hoechst 30 minutes avant l’analyse à une concentration de 0,2 μg/ml. Ajouter un volume adéquat de suspension cellulaire sur une lame de couverture ou un puits d’une plaque à fond plat à flancs noirs de 384 puits et examiner au microscope à fluorescence pour évaluer les cellules vivantes. Les cellules mortes ne conserveront pas la coloration nucléaire.
5. Criblage à haut débit (HTS) de petites molécules
- Préparez une suspension cellulaire à 2 x 106 cellules/mL de lymphocytes T activés (billes magnétiques ou anticorps/CD40L) ou de groupes non activés.
- Plaque 75 000 cellules/puits dans une plaque de 384 puits (volume de 40 μL). Utilisez une plaque à fond plat à flancs noirs à 384 puits ou une lame de couvercle de microscope pour l’évaluation de la viabilité et de l’activation par microscopie fluorescente (étape facultative de contrôle de la qualité avant le HTS) à l’aide d’un colorant Hoechst (voir les étapes 4.8 pour plus de détails).
- Manuellement ou à l’aide d’un système automatisé, ajoutez les médicaments de votre choix (dissous dans du diméthylsulfoxyde à 0,5 %, DMSO) dans chaque puits.
- Ajoutez le véhicule (DMSO) aux puits de contrôle positifs (activés) et négatifs (non activés). Ajustez la concentration de DMSO à un maximum de 0,5 %.
- Incuber les plaques pendant 24 h (ou temps d’incubation au choix) à 37 ºC et 5 % de dioxyde de carbone, CO2.
- Le jour du criblage, diluez la solution de coloration Hoechst 33342 (1:3,333 ; par exemple, ajoutez 10 μL aux cellules des plaques à 384 puits pour générer un volume total de 50 μL). Colorer 30 min avant l’analyse GFP en ajoutant une solution de Hoechst pour obtenir une concentration de 0,2 μg/mL.
- Pipetez doucement les cellules de haut en bas pour obtenir une distribution homogène dans chaque puits.
note: Cette étape est importante dans le cas de la distribution des médicaments (étape 5.3) à l’aide d’un système automatisé car les cellules ont tendance à s’accumuler d’un côté du puits, à l’opposé de la direction de l’écoulement.
- Faites tourner les assiettes à 45 x g pendant 3 min à température ambiante.
- Laissez reposer les plaques pendant 15 min à température ambiante.
- Effectuez la lecture des plaques à l’aide du système de criblage confocal automatisé à haut contenu (HCS). Chargez la plaque sur la machine. Réglez l’objectif à un grossissement de 40X ou plus. Utilisez la caméra #4 pour Hoechst (lampe UV) et la caméra #1 pour GFP (laser 488). Configurez la machine pour lire 6 à 10 champs par puits. Réglez la machine pour effectuer deux lectures séquentielles par champ à 488 nm (pour lire GFP) et à lumière UV (pour lire Hoechst). Réglez l’objectif à un grossissement de 40X ou plus.
note: Le système est un microscope informatisé qui ne nécessite aucun réglage. La distance focale, l’intensité de la lumière incidente et le temps d’exposition sont tous réglés automatiquement par la machine.
