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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Configuration de l’instrument
REMARQUE : L’imagerie des cellules en lévitation nécessite que deux aimants en néodyme de terres rares magnétisés sur l’axe z soient placés avec le même pôle face à face pour générer un champ magnétique. La distance entre les aimants peut être personnalisée en fonction de l’intensité du champ magnétique et de la densité des cibles. Dans ce cas, les aimants sont séparés par un espace de 1 mm suffisant pour l’insertion d’un tube capillaire en verre carré de 50 mm de long et de 1x1 mm. L’appareil a été imprimé en 3D à l’aide d’un modèle AutoCAD, disponible sur demande.
- Posez le microscope sur le côté, parfaitement horizontal.
note: Un microscope placé en position verticale standard n’est pas directement adapté à l’imagerie d’objets en lévitation en raison de la position des aimants par rapport au condenseur et à l’objectif. Cette limitation peut être contournée en posant le microscope sur le côté, parfaitement horizontal, ce qui permet au condenseur de concentrer la lumière dans le capillaire, et à la lentille de l’objectif d’imager la cellule en lévitation entre les aimants, tout en maintenant les exigences d’éclairage de Köhler.
- Soutenez et nivelez le support sur une table d’expérimentation à l’aide de 2 ou 3 prises de laboratoire.
- Pour limiter les vibrations, soutenez la table d’essai à l’aide de pieds amortisseurs en caoutchouc.
- Retirez la platine et remplacez-la par une prise jack de laboratoire compacte pour régler la hauteur du dispositif de lévitation (axe y) et deux platines de translation à axe unique : l’une pour régler la mise au point (axe z) et la seconde pour balayer le tube capillaire.
- Fixez le dispositif de lévitation magnétique à la prise jack du laboratoire à l’aide de deux poteaux optiques de mini-série.
2. Liaison de l’anticorps aux carboxy-microparticules/billes (modifié à partir d’un protocole par PolyAn)
REMARQUE : Seules les billes de faible densité (1,05 g/mL) doivent être enduites pour la détection de Rhès, Rh(+), mais les billes de haute et de basse densité sont enduites pour la détection des vésicules extracellulaires.
- Prélever l’équivalent de 1 mg de suspension de billes et l’ajouter à 0,5 mL de tampon d’activation (50 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique, MES (MW195.2, 9,72 mg dans 1 mL)) pH 5,0 et 0,001 % de polysorbate-20).
- Ajouter 12 μL de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) 1,5 M (MW 191.7, 0,28755 g dans 1 mL) fraîchement préparé et 12 μL de 0,3 M de sulfo-N-hydroxysuccinimide (NHS) (MW 217.14, 0,0651 g dans 1 mL) dans de l’eau glacée.
- Placez les tubes sur un agitateur orbital et agitez vigoureusement pendant 1 h à température ambiante pour activer les groupes carboxyle sur les billes.
- Arrêtez l’activation après 1 h en ajoutant 0,5 mL de tampon de couplage (10x solution saline tamponnée au phosphate, PBS ou 0,1 M de phosphate pH 7-9).
- Granulez les billes en les centrifugeant à 20 000 x g pendant 10 min, ou, si les billes ne peuvent pas être granulées, utilisez un filtre à tube de centrifugation de 0,45 μm. Aspirer le surnageant ou le flux traversant.
- Lavez les perles avec 1 ml de 10x PBS 3 fois comme à l’étape 2.5.
- Calculer 25 μg d’anticorps par billes de mg et mélanger l’anticorps désiré avec les billes activées jusqu’à obtenir une concentration finale d’anticorps de 0,7 à 1,0 mg/mL dans 10X PBS.
- Placez les tubes sur une bascule de tube réglée à basse vitesse. Roulez doucement les tubes à température ambiante pendant la nuit pour l’accouplement.
- Répétez l’étape 2.5 et lavez les perles deux fois avec 1 ml de 10x PBS.
- Laver avec 0,5 mL d’éthanolamine 1 M (98 % de matière première = 16,2 M) dans un tampon pH 8,0 avec 0,02 % de Polysorbate-20 pendant 1 h à température ambiante tout en secouant doucement.
- Répétez l'étape 2.5 et lavez les billes une fois dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Les billes peuvent être stockées dans 200 μL de DPBS à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
note: Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Collecte et préparation du sang pour la détection de Rh(+)
- À l’aide d’un autopiqueur en un clic, piquez le doigt d’un donneur de Rh(+) et prélevez 10 μL de sang dans 1 mL de DPBS.
- Colorez les cellules Rh+ avec une coloration à membrane plasmique fluorescente. Si vous le souhaitez, ajoutez 1 μL de colorant fluorescent à la suspension de 1 mL de cellules Rh+ (dilution 1:1000).
- Incuber les cellules avec le colorant fluorescent à 37 °C pendant 15 min.
- Granulez les cellules en les faisant tourner à 5 600 x g pendant 15 s et lavez-les 3 fois avec 1 mL de DPBS. Remettre en suspension dans 1 mL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) avec du calcium et du magnésium (HBSS++).
- À l’aide de l’autopiqueur en un clic, piquez le doigt d’un donneur de Rh(-) et prélevez 2 μL de sang.
note: Si vous préparez plus de 2 conditions, prélevez suffisamment de sang pour ajouter 1 μL de sang Rh(-) dans chaque tube.
- Préparez les tubes expérimentaux nécessaires : billes seules, contrôle de l’immunoglobuline G (IgG), échantillon.
- Perles seules : ajouter 174 μL de HBSS++, 1 μL de billes de contrôle IgG, 1 μL de billes haute densité (1,2 g/mL) et 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Contrôle IgG : ajouter 172 μL de HBSS++, 1 μL de billes de contrôle IgG, 1 μL de billes haute densité, 1 μL de sang Rh-, 1 μL de suspension de sang Rh+ coloré et 24 μL de 500 mM Gd3+.
- Le tube d’échantillon ajoute 172 μL de HBSS++, 1 μL de billes enrobées d’anti-RhD, 1 μL de billes haute densité, 1 μL de sang Rh-, 1 μL de suspension de sang Rh(+) coloré et 24 μL de 500 mM Gd3+.
note: Des billes de haute densité sont ajoutées aux échantillons Rh à titre de référence.
4. Analyse des cellules sur le dispositif de lévitation magnétique
- Effectuez le démarrage de l’instrument conformément aux instructions du fabricant.
- Chargez 50 μL d’échantillon dans un tube capillaire jusqu’à ce que le tube soit rempli. Scellez les extrémités du tube capillaire avec un scellant capillaire en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air.
- Chargez le tube capillaire dans le support entre les aimants supérieur et inférieur. Ajustez la platine et la mise au point pour une visualisation optimale.
note: Les cellules/billes peuvent prendre de 5 à 20 minutes pour atteindre leur position d’équilibre magnétique en fonction de leur densité et de la concentration de Gd3+. Plus la concentration de Gd3+ est élevée, plus le temps est court.