Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement des lymphocytes T CD4+ pour une analyse d’image
- Décongeler une aliquote de 1 mL contenant 107 cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) ou cellules mononucléées de ganglions lymphatiques (LNMC) congelées à partir d’échantillons prélevés. Dans une hotte stérile, ajoutez les cellules décongelées à 9 mL de RPMI complété par de la pénicilline/streptomycine et de la glutamine.
- Centrifuter les cellules pendant 10 min à 300 x g à 4 °C, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de RPMI supplémenté contenant 10 % de FBS (milieu complet). Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur deCO2 à 37 °C.
- Le lendemain, purifiez les lymphocytes T CD4+ par tri immunomagnétique négatif à l'aide d'un kit disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
- Pour mesurer le nombre de lymphocytes T CD4+ fraîchement purifiés, mélangez 5 μL de suspension cellulaire avec un volume égal d’une solution de bleu de trypan. Chargez un hémocytomètre avec un mélange de cellule-bleu de trypan et comptez les cellules vivantes à l’intérieur des 5 sections de l’hémocytomètre.
- Prenez la moyenne du nombre de cellules et déterminez le nombre de cellules dans la suspension de cellules d’origine : le nombre de cellules/1 mL = le nombre moyen x 2 x 104. Si le nombre total de cellules isolées est trop petit, utilisez-les telles quelles sans compter.
- Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 10 min et mettez-les en suspension dans un tampon de dosage (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glucose, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 et 1 % d’albumine sérique humaine) à 105 cellules/50 μL ou moins et maintenez les cellules à 4 °C (pendant 1 à 2 h) jusqu’au moment de dans les expériences.
- Éliminer tous les déchets biologiques conformément aux directives institutionnelles pertinentes.
- Si vous le souhaitez en tant que population de cellules témoins, préparer des lymphocytes T CD8+ activés à partir de PBMC de sang de cordon, placer 10 à7 cellules dans 5 mL de milieu complet dans un flacon de culture T25 recouvert d’un mélange d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28 à 10 μg/mL et 1 μg/mL, respectivement.
- Le lendemain, retirez les cellules de sang de cordon activées de la fiole, lavez-les 1x avec un milieu complet frais et dilatez les cellules en présence d’IL-2 recombinante (100 U/mL) pendant 2 semaines.
- Purifier les lymphocytes T CD8+ du sang de cordon par tri immunomagnétique négatif à l'aide de la trousse disponible dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant. Comptez les cellules et échangez le milieu dans le tampon de dosage comme décrit aux étapes 1.3 à 1.6 pour les cellules T CD8+ LN et PB.
2. Composants pour la préparation des bicouches lipidiques planes
- Préparez 3 types de liposomes comme décrit ailleurs : (a) 0,4 mM de liposomes DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), (b) 0,4 mM de liposomes DOPC contenant 33 % molaire de DOGS-NTA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (sel d’ammonium)) lipides, (c) 0,4 mM de liposomes DOPC contenant 4 % molaire de Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotine) (sel de sodium)).
- Préparez une solution de caséine à 5 % comme décrit précédemment.
- Dissoudre 5 g de poudre de caséine dans 100 mL d’eau ultrapure et ajouter 350 μL d’hydroxyde de sodium 10 M. Agitez le tout sur un agitateur magnétique ordinaire à une vitesse lente selon l’échelle disponible, à température ambiante pendant 2 h, puis toute la nuit à 4 °C. Ajustez le pH à 7,3 et ultracentrifugez la solution pendant 2 h à 100 000 x g à 4 °C. Filtrez le surnageant avec un filtre stérile de 0,22 μm et conservez la solution dans des aliquotes à -80 °C
prudence: La solution d’hydroxyde de sodium peut provoquer des brûlures chimiques et peut induire une cécité permanente au contact des yeux. Utilisez des gants en caoutchouc, des vêtements de sécurité et des lunettes de protection lorsque vous manipulez ce produit chimique ou ses solutions.
- Marquer les anticorps anti-CD3 avec de la biotine pour produire des molécules d’anticorps mono-biotinylées avec une approche décrite précédemment.
- Préparer une solution de Biotin-PEO4-NHS dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 0,1 mg/mL. Ajouter 3,7 μL de la solution Biotin-PEO4-NHS à 1 mg d’anticorps dans 0,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 100 mM de bicarbonate de sodium.
- Incuber le mélange pendant 2 h à température ambiante. Préparez une solution d’ester NHS d’Alexa Fluor 488 à 10 mg/mL dans du DMSO. Ajoutez la solution d’ester Alexa Fluor 488 NHS à l’anticorps marqué par Biotin-PEO4-NHS à un excès molaire de 10 fois.
- Incuber le mélange pendant 1 h à température ambiante en remuant lentement sur un agitateur magnétique ordinaire. Séparez le colorant non lié à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique.
- Déterminer la concentration d’anticorps en mesurant la densité optique de la solution d’anticorps à 280 nm (A280). Mesurer la densité optique des anticorps marqués à 577 nm (A577).
- Déterminez le rapport colorant/anticorps à l’aide de l’équation suivante :
3. Formation de bicouches lipidiques planes supportées par du verre
- Préparez une solution fraîche et acide de piranha en mélangeant 140 ml d’acide sulfurique concentré et 60 ml de peroxyde d’hydrogène à 30 %. Lavez les lamelles en verre pour les lames d’écoulement en les trempant dans la solution acide de piranha pendant 30 min. Tenez la lamelle en verre à l’aide d’une pince en polypropylène de type ciseaux.
prudence: La solution de piranha est un oxydant extrêmement puissant. N’oubliez pas de porter des lunettes de sécurité, des lunettes de protection ou un écran facial complet ainsi que des gants en caoutchouc épais à tout moment lors de la manipulation de la solution. Ne travaillez qu’avec une solution de piranha sous une hotte. Évitez de le chauffer, de le transporter ou de le secouer à tout moment pendant l’utilisation, car il pourrait exploser. Collectez les déchets de piranha dans une bouteille en verre avec un trou contenant du plomb. Communiquez avec le Comité de sécurité de l’établissement au sujet de l’utilisation appropriée des déchets.
- Rincez 7 fois les lamelles lavées à l’eau ultra-pure en les transférant séquentiellement dans des béchers contenant de l’eau douce. Mettez les lamelles humides de côté pour laisser l’eau restante s’écouler du verre propre, laissant le verre sec derrière vous.
- Vous pouvez également utiliser une pointe de pipette fixée à une pompe à vide pour retirer soigneusement les gouttelettes d’eau restantes des lamelles.
- Dans le capot stérile, effectuez des dilutions de divers lipides pour produire le mélange de liposomes pour la fabrication de bicouches. Tout d’abord, combinez 37 μL de liposomes DOPC et 3 μL de liposomes Biotinyl-Cap-PE. Deuxièmement, mélangez 14 μL de liposomes DOPC et 15 μL de liposomes DOGS-NTA. Troisièmement, ajoutez 1 μL du premier mélange à 29 μL du deuxième mélange pour fabriquer le mélange final de liposomes.
- Dans la hotte stérile, aménagez un espace de travail avec des lamelles sèches à proximité. Aliquote 2 μL du mélange final de liposomes (voir étape 3.3) précisément au centre d’un canal de lame autocollant. Alignez immédiatement et très précisément une lamelle propre et sèche avec la glissière et abaissez doucement la lamelle sur le côté collant de la glissière.
- Si vous préparez plus d’une lame, travaillez sur une lame à la fois car le mélange de liposomes s’évapore rapidement. Retournez la glissière et utilisez l’anneau extérieur de la pince en polypropylène de type ciseaux pour appliquer une légère pression sur le contact périphérique de la lamelle avec la glissière, en vous assurant que la glissière est bien fixée à la glissière pour éviter toute fuite.
note: N’appuyez pas contre les canaux de la glissière pour éviter de casser ou de fissurer la lamelle.
- Retournez à nouveau la glissière et marquez la position de la bicouche formée, qui ressemble à une goutte entre la lamelle et la glissière du canal, en traçant 4 points avec un marqueur permanent autour de la bicouche sur le côté extérieur de la glissière de l’ensemble.
- Avant la première injection d’un liquide dans le canal, désigner un orifice du canal comme orifice d’entrée et l’autre comme orifice de sortie, et maintenir cette désignation tout au long de l’expérience.
- Pour éviter de former des bulles, insérez l’extrémité de la pointe de la pipette directement dans l’orifice d’entrée du canal. Remplissez lentement les canaux de la lame avec 50 μL de tampon de dosage chaud (au moins à température ambiante) (voir l’étape 1.5 pour la composition du tampon).
- Préparez une solution de chlorure de nickel(II) 0,5 M. Décongeler une aliquote de 2 mL de solution de caséine dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min et la compléter par une solution de chlorure de nickel à une concentration finale de 200 μM.
- Lavez les bicouches en injectant d’abord 100 μL de la solution de caséine dans l’orifice d’entrée du canal, puis en retirant immédiatement 100 μL de l’orifice de sortie sur la lame par pipetage. Bloquez les bicouches avec la même solution en injectant 100 μL de la solution de caséine dans l’orifice d’entrée de chaque canal et en incubant la lame pendant 45 min à température ambiante.
- Décongeler les aliquotes des protéines Cy5-ICAM-1-His6 et de la streptavidine. Combiner les protéines dans le tampon de dosage à la concentration finale de 2 μg/mL chacune. Centrifuger la solution pendant 30 min à 20 000 x g et 4 °C pour éliminer tous les agrégats.
- Retirez le reste de la solution de blocage de l’orifice de sortie du canal coulissant par pipetage. Injecter 100 μL de la solution contenant ICAM-1 et la streptavidine dans l’orifice d’entrée.
- Incuber la lame pendant 45 min à température ambiante. Retirez tout excès de solution protéique de l’orifice de sortie. Lavez la bicouche 2x en injectant d’abord 100 μL de tampon de dosage dans l’orifice d’entrée du canal, puis en retirant immédiatement 100 μL de l’orifice de sortie.
- Diluer un anticorps anti-CD3 marqué à l’Alexa-Fluor-488 avec le tampon de dosage jusqu’à une concentration finale de 2 μg/mL. Injecter 100 μL de la solution d’anticorps dans l’orifice d’entrée de la lame et l’incuber pendant 45 min à température ambiante. Retirez tout excès de solution protéique de l’orifice de sortie. Lavez la bicouche 2x avec 100 μL de tampon de dosage comme à l’étape 3.11.
4. Imagerie de l’interaction des lymphocytes T avec la bicouche planaire
- Préchauffez la platine et l’objectif d’un microscope confocal ou à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) jusqu’à ce que la température soit équilibrée à 37 °C. Installez la lame avec le(s) bicouche(s) sur la platine chauffée. Déplacez la platine à une position appropriée en fonction des marques d’encre et concentrez-vous sur la bicouche utilisant la fluorescence des molécules ICAM-1 marquées au Cy.
- Utilisez un objectif 61X pour le microscope confocal, ou un objectif 100X pour le microscope TIRF, avec les paramètres de filtre appropriés.
- Pour l’imagerie à libération de granules par microscopie TIRF, ajoutez des fragments d’anticorps anti-CD107a marqués à l’Alexa-Fluor-568 à la suspension cellulaire à une concentration finale de 4 μg/mL avant d’injecter les cellules dans les orifices d’entrée.
- Remettre en suspension les lymphocytes T CD4+ préparés isolés du LN, du PB ou du sang de cordon et injecter 50 μL de la suspension cellulaire dans l’orifice d’entrée du canal de glissement contenant la bicouche.
- Choisissez le nombre de champs souhaité et enregistrez des images de chaque champ 1x toutes les 2 minutes pendant 30 minutes après l’injection.
- Exploitez le fond clair, la lumière réfléchie et les canaux fluorescents (Alexa 488 et Cy5) du microscope confocal pour acquérir les images. Utilisez le mode TIRF pour la fluorescence Alexa-Fluor-488 et Alexa-Fluor-568 et le champ large pour la fluorescence Cy5, ainsi que l’imagerie en fond clair, sur le microscope TIRF.
