Effet d’un agent pharmacologique immunomodulateur sur l’interaction entre les cellules dendritiques et les lymphocytes T CD4+

Résumé

Source : Wei, H., et al. Développement et caractérisation fonctionnelle de cellules dendritiques tolérogènes murines. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Cette vidéo présente une méthode de conversion de cellules dendritiques (DC) en DC tolérogènes (TolDCs) à l’aide d’un agent pharmacologique immunomodulateur. Cette conversion est confirmée par l’évaluation de la fonction de TolDC à travers leur effet immunosuppresseur sur les lymphocytes T CD4+.

Protocole

1. Évaluer la fonction des TolDC In Vitro et In Vivo

1. Essai de prolifération syngénique des lymphocytes T
   1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux par autoclave et effectuez l’expérience dans une enceinte de sécurité biologique de classe II avec des procédures de sécurité appropriées.
   2. Préparez le tampon MACS en utilisant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA dans 500 ml de PBS. Stérilisez le tampon en filtrant à travers un filtre de 0,2 μm.
      note: Gardez le tampon sur la glace pendant l’expérience suivante.
   3. Pour obtenir des lymphocytes T CD4+, euthanasier des souris transgéniques à récepteur des lymphocytes T (TCR) OT-II âgées de 8 à 10 semaines à l’aide d’une chambre à CO₂. Placez la souris sur une planche de dissection et rincez-la à l’éthanol à 70 %. Isolez la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces.
   4. Mettez la rate avec 2 ml de PBS dans une boîte de culture de 6 cm et utilisez le dos du poussoir d’une seringue de 3 ml pour émincer la rate en passant une passoire à cellules de 40 μm.
   5. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
   6. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 400 μl de tampon MACS.
   7. Ajouter 100 μl de cocktail de biotine-anticorps à cellules T CD4+ à 4 °C pendant 5 min.
      note: Le cocktail d’anticorps se lie à d’autres types de cellules, à l’exception des lymphocytes T CD4+, tels que CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-CMH de classe II, Ter-119 et TCRγ/δ.
   8. Ajouter 300 μl de tampon MACS et 200 μl de billes d’anti-biotine (Table des matériaux) à 4°C pendant 10 min.
   9. Placez la colonne composée de sphères ferromagnétiques (Table des matériaux) et du filtre de pré-séparation dans le champ magnétique et rincez-la avec 3 ml de tampon MACS.
   10. Ajouter 9 ml de tampon MACS dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
   11. Remettez la pastille de cellule en suspension dans 3 ml de tampon MACS et appliquez-la sur la colonne. Prélever les cellules T CD4+ à flux continu.
   12. Lavez la colonne avec 3 ml supplémentaires de tampon MACS et récupérez également le flux.
   13. Pour obtenir des DC de casserole splénique, euthanasier les souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines à l’aide d’une chambre à CO₂. Placez la souris sur une planche de dissection et rincez-la à l’éthanol à 70 %. Isolez la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces. Mettez la rate dans une boîte de culture de 6 cm contenant 2 ml de solution de collagénase D (2 mg/ml de collagénase D dissoute dans HBSS contenant du calcium et du magnésium).
   14. Injectez 1 ml de solution de collagénase D dans la rate deux fois avec une seringue de 1 ml et une aiguille de 25 G. Coupez la rate en petits morceaux avec de petits ciseaux.
   15. Agiter et incuber à température ambiante pendant 25 minutes.
   16. Ajouter 500 μl d’EDTA 0,5 M à température ambiante pendant 5 min.
       note: Les étapes 1.1.13-1.1.14 sont essentielles pour augmenter le rendement des DC.
   17. Utilisez maintenant l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml pour émincer la suspension de rate en passant une crépine cellulaire de 40 μm et recueillir la suspension cellulaire en centrifugeant à 300 x g pendant 5 minutes.
   18. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 350 μl de tampon MACS, 50 μl de réactif bloquant FcR et 100 μl de cocktail biotine-anticorps à 4 °C pendant 10 min.
       note: Cocktail d’anticorps contre des antigènes qui ne sont pas exprimés par les DC.
   19. Lavez les cellules en ajoutant 9 ml de tampon MACS et centrifugez à 300 x g pendant 5 min.
   20. Remettre la pastille en suspension dans 800 μl de tampon MACS et ajouter 200 μl de billes d’anti-biotine à 4°C pendant 10 minutes.
   21. Répétez les étapes de 1.1.9 à 1.1.11 pour collecter les DC.
   22. Lavez la colonne avec 3 ml supplémentaires de tampon MACS deux fois et récupérez également le flux.
   23. Traitez les 2 x 10⁵ DCs/ml en présence ou en l’absence de CDDO-DFPA de 100-400 nM à 37°C pendant 1 h. Séparément, étiquetez les lymphocytes T CD4+ (1 x 10⁷/ml) avec 1 μM CFSE à 37°C pendant 15 min, lavez avec du PBS et réajustez le volume pour obtenir la concentration finale à 2 x 10⁶ lymphocytes T/ml.
   24. Ensuite, dans une plaque de 96 puits, co-cultivez 100 μl des cellules dendritiques traitées avec le même volume de cellules T CD4+ marquées au CFSE, toutes deux collectées à partir des étapes ci-dessus pour obtenir un rapport de 1:10. Ajoutez maintenant 100 ng/mL de peptide d’ovalbumine (OVA) 323-329 par puits et mesurez l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après 2-3 jours d’incubation.
       note: Le nombre de cellules et le rapport entre les cellules DC et T ont été optimisés par rapport à nos travaux précédents.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	synthèse maison	Culture cellulaire
Souris GM-CSF	Peprotech Inc	Référence 315-03	Différenciation BMDC
Kit d’isolement de cellules pandritiques	Miltenyi Biotec Inc.	Tél. : 130-100-875	Essai de prolifération des lymphocytes T
Cocktail de biotine-anticorps de cellules panddritiques	Miltenyi Biotec Inc.	Tél. : 130-100-875	Essai de prolifération des lymphocytes T
Kit d’isolement des lymphocytes T CD4+	Miltenyi Biotec Inc	Tél. : 130-104-454	Essai de prolifération des lymphocytes T
Le	BioLégende	423801	Essai de prolifération des lymphocytes T
Réactif bloquant FcR	Miltenyi Biotec Inc.	Tél. : 130-100-875	Essai de prolifération des lymphocytes T
Microbilles anti-biotine	Miltenyi Biotec Inc.	Tél. : 130-104-454	Essai de prolifération des lymphocytes T
Seringue de 1 ml	BD Biosciences	309626	Essai de prolifération des lymphocytes T
Bsa	Sigma Aldrich Inc	A2058	Essai de prolifération des lymphocytes T
Edta	ThermoFisher Scientific	15575020	Essai de prolifération des lymphocytes T
Colonne LS	Miltenyi Biotec Inc.	Tél. : 130-042-401	Essai de prolifération des lymphocytes T
Filtre de pré-séparation	Miltenyi Biotec Inc	Tél. : 130-095-823	Essai de prolifération des lymphocytes T
Collagénase D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	Essai de prolifération des lymphocytes T
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	Essai de prolifération des lymphocytes T
Peptide d’ovalbumine (OVA) 323–329	Sigma Aldrich Inc.	O1641	Essai de prolifération des lymphocytes T