Une technique in vitro pour visualiser l’exocytose des granules sécrétoires dans les mastocytes

Résumé

Source : Klein, O., et al. Imagerie FITC-dextran en tant que rapporteur pour l’exocytose régulée J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre une technique pour visualiser l’exocytose dans les mastocytes. Les cellules sont incubées avec du FITC-dextran – un rapporteur fluorescent – qui est absorbé par les cellules à l’intérieur des granules sécrétoires (SG), où le pH acide éteint sa fluorescence. Lors de la stimulation de l'exocytose granulaire, le pH plus élevé du milieu induit une fluorescence rapporteure à l'intérieur des SG fusionnés, qui est visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Protocole

1. Préparatifs

1. Préparation des milieux de culture RBL (RBL-2H3 mastcell line)
   1. Mélanger 500 mL de milieu modifié Eagle's à faible teneur en glucose (DMEM) avec 56 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 5,5 mL de solution de pénicilline-streptomycine-nystatine, 5,5 mL de solution de L-Glutamine 200 mM. Il en résulte un faible taux de glucose DMEM complété par 10 % de FBS, 100 μg/mL de streptomycine, 100 unités/mL de pénicilline, 12 unités/mL de nystatine et 2 mM de L-glutamine.
   2. Filtrez le média à l’aide d’un filtre à vide supérieur de 0,22 μm et stockez-le à 4 °C.
2. Maintenance des cellules RBL.
   1. Cultivez des cellules RBL jusqu’à une confluence maximale de 90 % dans une boîte de 10 cm. Si la culture cellulaire est saine, les cellules doivent avoir une forme de fuseau avec des protubérances occasionnelles.
   2. Pour la séparation des cellules, détachez les cellules de la boîte en aspirant le milieu et en le remplaçant par 2 mL de trypsine/EDTA solution B. Incuber pendant 5 à 10 minutes dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   3. Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine en ajoutant 2 ml de milieu de culture, à l’aide d’une pipette, et divisez les cellules dans un rapport de 1:2 à 1:10.
3. Préparation de 20x tampon Tyrode
   1. Préparez une solution mère 20x de 54 mM de KCl, 20 mM de MgCl₂, 2,74 M de NaCl et 8 mM de NaH₂PO₄ dans de l’eau doublement distillée (DDW). Bien mélanger et conserver à 4 °C.

2. Culture de cellules RBL pour la microscopie à cellules vivantes

1. Préparation de la solution FITC-dextran.
   1. Mélanger 1 mg de poudre d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran (150 K) par 1 mL de milieu de culture (voir l’étape 1.1.1). Pour un verre de protection à chambre pleine, préparer 3 ml.
   2. À l’aide d’une unité de filtre à seringue en acétate de cellulose avec des pores de 0,22 μm, filtrez le FITC-dextran dissous.
   3. Ajouter des immunoglobulines E (IgE) de souris à une concentration de 1 μg/mL.
2. Ensemencement de cellules RBL pour l’imagerie
   1. La veille de l’imagerie, aspirez le milieu de la boîte de culture et remplacez-le par 2 mL de solution B de trypsine et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Incuber pendant 5 à 10 minutes dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C. Une fois les cellules détachées, neutralisez la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu de culture.
   2. Comptez les cellules RBL à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez le volume en conséquence avec des milieux de culture pour obtenir une concentration cellulaire de 7,5 x 10⁵/mL.
   3. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire dans un verre de protection pré-rempli de milieux de culture frais supplémentés en FITC-dextran (cela donne l’ensemencement de 7,5 x 10³ cellules dans une chambre).
   4. Cultivez des cellules RBL pendant la nuit dans une atmosphère humifiée de 5 % de CO₂ à 37 °C. Les cellules doivent rester à un niveau sous-confluent afin de s’assurer qu’elles sont séparées et qu’il est facile d’identifier chaque cellule individuellement au microscope.
3. Transfection des cellules RBL - facultatif.
   1. Pour l’imagerie des événements exocytaires en combinaison avec d’autres protéines marquées par fluorescence, voir le protocole de transfection pour les cellules RBL dans Azouz et al.

3. Microscopie à cellules vivantes de l’exocytose

1. Préparation des solutions :
   1. Préparez une solution tampon finale de Tyrode en diluant la solution mère dans DDW dans une dilution de 1:20 et complétez avec 20 mM de Hepes pH 7, 1,8 mM de CaCl₂, 1 mg/mL d'albumine sérique bovine (BSA) et 5,6 mM de glucose.
   2. Préparez fraîchement un réactif sécrétagogue 20x dans le tampon de Tyrode [1 μg/mL de dinitrophényle conjugué à de l'albumine sérique humaine (DNP-HAS (Ag)) dans notre cas, pour une concentration de 50 ng/mL 1x].
   3. Préparez une solution de chlorure d'ammonium de 400 mM en dissolvant la poudre dans le tampon de Tyrode.
2. Préparation des cellules.
   1. Lavez le verre de protection à chambre 3 fois en aspirant le média de la chambre et en le remplissant à nouveau avec 300 μL de tampon Tyrode, préchauffé à 37 °C. Enfin, remplissez la chambre avec 300 μL de tampon Tyrode, préchauffé à 37 °C.
   2. Placez le verre de protection dans la chambre d'incubation du microscope. Assurez-vous que la chambre est stable.
3. Configuration du microscope
   1. Pour choisir une région d’intérêt à suivre, allumez la source de lumière fluorescente (traditionnellement une lampe au mercure) et choisissez le filtre de fluorescence approprié (choisissez le filtre pour fluorophores verts pour l’affichage du FITC-dextran). Une fois que la zone d’intérêt est nette et se trouve au milieu du champ de vision, éteignez la source lumineuse afin d’éviter le photo-blanchiment et la toxicité.
      REMARQUE : Une partie du FITC-dextran incorporé dans les cellules peut conserver la fluorescence. En effet, le FITC-dextran peut également être trié dans des compartiments non lysosomales tels que les endosomes.
   2. Allumez l’éclairage approprié pour l’excitation FITC. Si vous utilisez un microscope laser, allumez le laser 488 nm. L’émission doit être collectée autour de 500 - 550 nm (pics d’émission FITC à 510 - 520 nm).
   3. Lors de l’utilisation d’un microscope confocal, ouvrez le sténopé au maximum. Cela permettra d’utiliser une puissance laser plus faible pour éviter le blanchiment et la toxicité et assurera la capture des événements d’exocytose à partir de tous les plans de la cellule.
   4. Calibrez l’intervalle de temps entre les acquisitions d’images.
      1. Différentes cellules peuvent varier dans leur cinétique d’exocytose régulée. Pour l’imagerie spécifique de l’exocytose composée, nous recommandons un intervalle de temps d’au moins 5 secondes. Cependant, en règle générale, pour permettre une imagerie rapide, assurez-vous que le temps d’acquisition d’une seule image est rapide.
      2. Lorsque vous utilisez un microscope confocal à balayage laser, réglez la direction de balayage sur bidirectionnelle, ne tenez pas compte de la moyenne et réglez la résolution à 512 x 512 (recommandé ; les deux dernières dispositions aideront également à minimiser le blanchiment et la toxicité).
4. Imagerie de l’exocytose.
   1. Imagez les cellules pendant les durées souhaitées, en fonction du type de cellule ou de sécrétagogue. Dans les cellules RBL déclenchées par des IgE/Ag, la plupart des événements exocytaires se produisent dans les 15 à 20 minutes suivant l’activation.
   2. Pour l’activation des cellules, ajoutez 16 μL de la solution de sécrétagogue 20x dans la chambre.
5. Confirmation de la présence de FITC-dextran dans les cellules.
   1. Pour confirmer la présence et la localisation du FITC-dextran dans les SG, ajoutez doucement 16 μL de solution de chlorure d’ammonium (attention à ne pas déplacer la chambre pour ne pas perdre la concentration) dans la chambre (cela fera une concentration finale de 20 mM). Cela induira l’alcalinisation des SG et la détrempe de la fluorescence FITC, qui se produira en quelques secondes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM faible teneur en glucose	Inductions biologiques	Référence 01-050-1A
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 12657
Solution Pen-strep-nystatine	Inductions biologiques	Référence 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Inductions biologiques	Référence 03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	Réf. 46946-500MG-F
Trypsine/EDTA Solution B	Inductions biologiques	Référence 03-052-1A	Réchauffer au bain-marie à 37 °C avant utilisation
Filtre à vide par le haut de 0,22 μm de taille de pores	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Unité de filtre pour seringue en acétate de cellulose, taille des pores de 0,22 μm	Sartorius	16534K
Verre de protection à chambre	Thermo scientifique	155411
Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A4503
IgE monoclonale anti-DNP	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Évitez l’exposition directe à la lumière
Tampon Hepes 1M, pH 7,4	Inductions biologiques	Référence 03-025-1B
CaCl2	Merk	102382
glucose	Laboratoires BDH	284515V
Chlorure d’ammonium	Merk	Référence 1145
PIPES sel dipotassique	Sigma-Aldrich	Référence 108321-27-3
Hydrate d’acétate de calcium	Sigma-Aldrich	Référence 114460-21-8
Acétate de magnésium tétrahydraté	Sigma-Aldrich	Référence M5661
Glutamate de potassium (acide L-glutamique, sel de potassium monohydraté)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	Merk	Référence 6346
NaCl	Merk	106404
MgCl2	Merk	105833
Kcl	Merk	104936
Électroporateur	BTX	ECM830
Microscope confocal, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Utilisé dans la figure 3. Équipé d’un système électronique à température contrôlée
incubateur airstream
Microscope confocal, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Utilisé dans la figure 2. Equipé d’un détecteur GaAsP, d’un
incubateur airstream
Microscope confocal, Leica	Leica	SP5	Utilisé dans la figure 1. Équipé d’un détecteur Leica HyD et d’un incubateur de pointe (okolab)
Cellules RBL-2H3			Les cellules RBL-2H3 ont été clonées dans le laboratoire de Reuben P. Siraganian. Voir référence 67