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1. Conjugaison de l’antigène protéique au lipide pégylé
- Ajouter 3 g de billes de gel de dextran réticulé avec une plage de fractionnement de 1 500 à 30 000 daltons (Da) dans une fiole isotherme de 250 ml. Ajouter 60 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remuer continuellement avec une barre d’agitation magnétique. Fermez le ballon et fixez-le à vide pour initier le dégazage sur une plaque d’agitation pendant au moins 1 h.
- Dans une colonne de chromatographie sur verre de 1,0 cm x 30 cm avec le bouchon de rotation fermé, ajoutez du PBS à la colonne à laver. Ouvrez le bouchon de retournement et vidangez la colonne. Après le lavage, ajoutez la boue de billes dégazées dans la colonne. Ajouter continuellement le lisier jusqu’à ce que la colonne soit tassée à une hauteur de cordon d’environ 24 cm.
- Une fois que la colonne a une « tête » d'environ 4 à 5 cm de PBS au-dessus des billes tassées, préparez les étapes suivantes.
- Créez un siphon à écoulement par gravité en mesurant un morceau de tube suffisamment long pour atteindre une étagère de 1 à 2 pieds au-dessus du haut de la colonne et créez une boucle qui descend près du bas de la colonne et revient au sommet de la colonne. Ajoutez un bouchon de retournement à une extrémité du tube, en laissant un côté du tube ouvert. Placez l’extrémité ouverte du tube dans une bouteille de 500 ml de PBS et placez-la sur l’étagère au-dessus de la colonne.
- Prenez l’extrémité avec le bouchon de retournement et fixez-y une seringue de 10 ml. Ouvrez la vanne d’arrêt de retournement sur la conduite de tube et aspirez le PBS à travers le tube. Une fois que le PBS a atteint les trois quarts de la tubulure, retirez rapidement la seringue et ajoutez le bouchon de retournement en haut de la colonne - le liquide doit couler sur la colonne.
REMARQUE : La quantité de « tête » de PBS restante sur le dessus de la colonne doit être comprise entre 1 et 3 cm. La quantité minimale pour laver la colonne est de 3 volumes de colonne.
- Déterminer la quantité de protéines (moles) à relier aux lipides en fonction de son poids moléculaire (MW).
REMARQUE : Le fragment Fab de l’immunoglobuline anti-souris de chèvre, IgM (lui-même une IgG) est utilisé ici comme antigène de substitution universel pour la stimulation polyclonale des lymphocytes B. En conséquence, le fragment Fab d’IgG de chèvre a une masse moléculaire d’environ 48 kiloDalton (kDa) et est disponible dans le commerce en quantité totale de 1,3 mg. Ainsi, la quantité de protéines à lier est de 27,1 μmol.
- Déterminer le coefficient d’extinction de la protéine d’intérêt. Si elle n’est pas connue, mesurer l’absorbance protéique à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre et diviser la valeur de A280 par le nombre de moles calculé à l’étape 1.4.
REMARQUE : Le coefficient d’extinction de Fab des IgG de chèvre à 280 nm est de 64 600 M-1.
- Pour s’assurer que les traces du tampon contenant des amines sont éliminées, dessalez la protéine sur la colonne créée aux étapes 1.1 à 1.3 et collectez les fractions protéiques dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (~500 μL par fraction).
- Fermez la vanne d’arrêt de retournement reliée au haut de la colonne et retirez le haut de la colonne. Si ce n'est pas déjà fait, ouvrez la vanne d'arrêt de retournement au bas de la colonne et attendez que la « tête » du PBS heurte le haut des billes.
- Ajouter lentement la protéine d’intérêt sur le dessus des billes à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, en prenant soin de minimiser les perturbations vers le haut des billes.
- Une fois que la « tête » de la solution protéique a atteint le sommet des billes, ajoutez doucement 1 mL de PBS à l'aide d'une pipette Pasteur. Répétez l’opération trois fois. Ajoutez du PBS pour créer une tête de 4 à 5 cm et répétez l’étape 1.3 pour laver la colonne.
REMARQUE : Cette étape peut être ignorée s’il est certain qu’aucun tampon contenant des amines n’est présent.
- Déterminez les fractions qui contiennent des protéines en mesurant les valeurs A280 et regroupez les fractions qui donnent une récupération d’environ 90 % de la protéine.
REMARQUE : Cela dilue généralement la protéine 1,5 à 2 fois. Déterminer la concentration en protéines après le regroupement. Concentrez la protéine à cette étape, si nécessaire, à l’aide d’un concentrateur de centrifugation.
- Ajouter l’équivalent molaire de 2,5 molaires de l’agent de réticulation hétérobifonctionnel à la protéine.
- Tout d’abord, peser environ 5 mg de 3-(2-pyridyldithio)propionate de succinimidyle (SPDP, MW = 314 g/mol) dans un tube de microcentrifugation. Pour déterminer le volume nécessaire pour dissoudre le SPDP, il faut prendre plusieurs fois la concentration molaire de la protéine et 250x pour générer une solution 100x qui donnera un excès de 2,5 molaires dans la réaction.
REMARQUE : Par exemple, si la concentration en protéines est de 50 μM, une solution de SPDP à 12,5 mM est nécessaire. Pour 5 mg de SPDP, cela correspond à 1,27 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Ajouter du SPDP à la protéine d’intérêt à une dilution de 1:100. Placez la réaction sur un agitateur oscillant à température ambiante (RT) pendant environ 1 h.
- Pour éliminer l’excès de SPDP et protéger la ou les liaisons disulfure endogènes, dans la protéine lors de l’étape de réduction suivante, équilibrez et lavez la colonne créée aux étapes 1.1 à 1.3 dans 100 mM d’acétate de sodium (NaOAc) à pH 5,5 ou créez une colonne identique uniquement pour une utilisation dans ce tampon.
- Après 1 h d’incubation avec SPDP, dessaler la protéine sur la colonne équilibrée en 100 mM de NaOAc. Effectuez cette étape de la même manière que l’étape 1.6, sauf en utilisant 100 mM de NaOAc (pH 5,5) comme éluant. Collectez les fractions, déterminez le A280 et regroupez les fractions supérieures. Lavez la colonne dans PBS.
- Préparez une solution de 2,5 M de DTT (MW = 154 g/mol) dans de l’eau doublement distillée (ddH2O). Ajouter 25 mM de DTT aux fractions de protéines regroupées pendant 5 à 10 min.
- Mesurez l’A280 de la protéine et divisez-le par le coefficient d’extinction. Déterminez également l’A343. Calculez le rapport de liaison en fonction de la molarité de la protéine (A280) et de l’agent de liaison (A343).
REMARQUE : Désactivez l’étalonnage automatique de l’A340 si vous utilisez un spectrophotomètre à nanogouttes. La mesure A343 représente l’absorbance du groupe pyridine 2-thione (coefficient d’extinction = 7550 M-1) qui est éliminé de l’agent de réticulation SPDP par la TNT. Un rapport molaire de liaison / protéine de 1,2 à 1,5 est généralement obtenu lors de la réalisation de la réaction avec un excès de 2,5 molaires de SDPD sur une large gamme de protéines.
- Exécutez les fractions regroupées sur la colonne lavée dans PBS comme décrit ci-dessus. Collectez les fractions, déterminez le A280 et mettez en pool les fractions supérieures. Déterminer la concentration de protéines par A280 après avoir regroupé les fractions.
- Préparez DSPE-PEG(2000)-Maléimide (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000)-Maléimide. Celle-ci sera ajoutée à la protéine selon un rapport molaire de 10:1. Préparez une quantité 100x de DSPE-PEG(2000)-Maleimide pour obtenir la concentration souhaitée.
- Par exemple, si la concentration en protéines est de 10 μM après l’étape 1.14, préparer une quantité stock de DSPE-PEG(2000)-Maléimide à 10 mM. Pesez soigneusement le DSPE-PEG(2000)-Maléimide (MW = 3000 g/mol) et ajoutez la quantité appropriée de DMSO. Plusieurs cycles de vortex et de sonication doux peuvent le dissoudre complètement.
- Déterminer le volume total des fractions à l’étape 1.14 et transvaser soigneusement la solution dans une petite fiole à fond rond (10 à 25 ml). Ajoutez la quantité appropriée de 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimide à la protéine pour obtenir une concentration finale de 1x, 10 fois l’excès molaire. Agitez doucement la solution pour vous assurer que le DMSO est complètement dispersé.
- Exécutez la réaction pendant la nuit sous l’azote dans un RBF scellé. Utilisez un septum en caoutchouc et placez-le dans une hotte.
- Évacuez l’atmosphère en perforant le septum à l’aide d’une aiguille de 20 g attachée à une seringue de 3 mL à l’extrémité du tube fixé à un aspirateur, puis allumez l’aspirateur pendant 3 à 5 s.
- Remplacez l’atmosphère par de l’azote. Remplissez un ballon attaché à une seringue de 3 mL, coupé en deux avec de l’azote et fixez-y une aiguille de 20 G. Percez le septum pour remplir l’atmosphère à l’intérieur du ballon à fond rond avec de l’azote. Répétez l’élimination de l’atmosphère et le remplacement par de l’azote une fois de plus et laissez le ballon d’azote attaché pendant la nuit.
- Préparez une colonne de billes de gel de dextran réticulé séparée avec une plage de fractionnement de 4 000 à 150 000 Da dans une colonne de chromatographie sur verre de 1,0 cm x 50 cm (selon les étapes 1.1 à 1.3).
- Le lendemain, prélever la protéine de la fiole à fond rond préparée à l’étape 1.17 et passer (suivre la méthode utilisée à l’étape 1.6) sur la colonne de billes de gel de dextran réticulé (à l’étape 1.18).
REMARQUE : La quantité totale à charger sur la colonne ne doit pas dépasser 2 ml. Si une réaction plus importante a été utilisée, divisez-la en deux et exécutez-la sur des colonnes séparées ou sur une colonne de plus grand diamètre.
- Collectez les fractions, déterminez l’A280, regroupez les fractions supérieures et déterminez la concentration des protéines. La présence du lipide n’affectera pas les mesures.
- Conservez les fractions finales de protéines liées aux lipides à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
2. Préparation des liposomes
- Peser les lipides : DSPE-PEG(2000) (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000, MW = 2805,5 g/mol ; Cholestérol (3b-hydroxy-5-cholesté, 5-cholesten-3b-ol), MW = 386,7 g/mol ; et DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790,1 g/mol. Créer une solution de DSPC à 5 mg/mL, une solution de cholestérol à 4 mg/mL et une solution de DSPE-PEG(2000) à 2 mg/mL dans du chloroforme.
- S’assurer que le rapport molaire des lipides dans les liposomes est de 57 % de DSPC, 38 % de cholestérol et 5 % de DSPE-PEG (2000), comme indiqué dans le tableau 1.
REMARQUE : Il est important de contrôler la quantité d’antigène sur le liposome, qui varie généralement de 0,01 à 0,1 %. Dans le tableau 1, 0,1 % du fragment IgM Fab anti-souris de chèvre lié au lipide pégylé est utilisé. Il est essentiel de prendre en compte l’excès molaire de 10 fois de DSPE-PEG(2000)-Maléimide qui a été ajouté à la protéine à l’étape 1.15, pour s’assurer que la quantité totale de lipides pégylés ne dépasse pas 5 %.
- Tenez compte des quantités finales de lipides (μmol) lors de la création de lipides pour l’extrusion. Voir le tableau 1 pour un exemple de calcul des concentrations molaires en lipides pour la création de liposomes à une concentration totale en lipides de 1,25 μM.
- Une fois que la quantité correcte de chaque lipide à additionner a été calculée, combinez le tout dans un tube à essai en verre borosilicaté de 12 ml.
- Soufflez soigneusement le chloroforme.
- À l’aide de la tubulure et d’une seringue de 3 mL à l’aide d’une aiguille, préparée à l’étape 1.17.1, pour souffler soigneusement le chloroforme dans le tube contenant de l’azote. Soufflez doucement un jet d’azote sur la solution tout en faisant pivoter le tube avec l’autre main. Veillez à minimiser les éclaboussures ou à faire couler le liquide sur le côté du tube, car il peut être plus difficile de le mettre en solution à l’étape suivante.
- Ajoutez 100 μL de DMSO dans chaque tube et lyophilisez cette solution pendant la nuit. Couvrez le haut du tube avec une lingette de laboratoire non statique, fixez-le avec un élastique et congelez-le à -80 °C.
3. Extrusion de liposomes
- Ajouter 1 mL de PBS contenant la protéine liée aux lipides dans le tube de 12 mL contenant les lipides. Soniquez la solution pendant environ 30 secondes à 1 minute dans un bain-marie de sonication. Laissez reposer 5 minutes ou plus entre chaque tour et répétez l’opération 3 à 4 fois.
- Préparez une extrudeuse selon les instructions du fabricant.
- Ajoutez les supports de filtre au support de membrane interne et déposez quelques gouttes (10 μL chacune) de PBS sur un film de paraffine. À l’aide d’une pince à épiler, saisissez un bord du support de filtre et trempez-le dans la goutte de 10 μL.
- Placez le filtre à l’intérieur du joint torique. Faites-le pour les deux côtés. À l’aide d’une pince à épiler, saisissez un filtre de 0,8 μm sur le bord, trempez dans la goutte de 10 μL et enduisez l’extérieur du joint torique de PBS. Placez doucement le filtre de 0,8 μm sur le joint torique afin que le filtre ne dépasse pas du support de membrane interne.
- Placez le bloc chauffant de l’extrudeuse sur une plaque chauffante pour préchauffer l’extrudeuse. Mettez la plaque chauffante à basse température et laissez le bloc chauffant de l’extrudeuse atteindre la température souhaitée. Pour éviter d’éventuels problèmes d’agrégation des protéines, ne chauffez pas le bloc au-delà de 37 °C.
- Chargez l’échantillon soniqué dans l’une des seringues d’extrusion placées dans l’extrudeuse. Placez la seringue de l’extrudeuse dans l’autre extrémité de l’extrudeuse. Assurez-vous que le piston de la seringue vide est réglé à zéro. La seringue vide se remplira au fur et à mesure que le lipide sera extrudé à travers la membrane en polycarbonate de 0,8 μm. Essayez d’éviter de faire passer des bulles d’avant en arrière à travers la membrane.
- Placez l’extrudeuse entièrement assemblée dans le bloc chauffant. Poussez doucement le piston de la seringue remplie de lipides jusqu’à la seringue vide. En fonction de la concentration en lipides, il sera difficile de s’en sortir. Répétez l’opération 20 fois.
- Retirez l’extrudeuse entièrement assemblée du bloc chauffant. Retirez lentement la seringue remplie de l’extrudeuse, assurez-vous de recueillir tous les lipides qui pourraient s’échapper lors du retrait. Placez les liposomes dans un flacon propre. Répétez les étapes 3.4 à 3.6 en utilisant des membranes en polycarbonate de 0,2 μm et 0,1 μm.
- Créez une colonne de billes d’agarose réticulée de0,7 x 50 cm 2 avec une plage de séparation de 0,7 à 10 méga daltons (MDa) équilibrée en PBS. Ajoutez les liposomes et exécutez comme à l’étape 1.6. Les fractions contenant des liposomes auront une transmission de la lumière réduite dans la gamme de 250 à 400 nm.
- Conservez les liposomes à 4 °C et ne les congelez pas.
4. Flux de calcium pour surveiller l’activation des lymphocytes B par les liposomes antigéniques
- Euthanasier les souris par surdose de dioxyde de carbone (CO2) ou d’isoflurane, conformément aux procédures opérationnelles normalisées de l’établissement. Confirmer l’euthanasie des souris par luxation cervicale.
- Stérilisez les instruments chirurgicaux et la carcasse des souris avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez une pince à iris incurvée de 10 cm de long, 0,8 mm pour séparer la peau recouvrant la cavité thoracique de la cage thoracique. Utilisez des ciseaux de dissection droits de 10 cm de long pour faire une incision distale avec une incision bilatérale.
- Utilisez une pince à iris incurvée et des ciseaux de dissection pour extraire la rate de la cavité abdominale. Retirez le tissu adipeux entourant la rate, puis placez-le dans un tube conique en polystyrène de 15 ml rempli d’RPMI1640 milieu contenant 1 % de sérum de veau fœtal (SCF) et de pénicilline-streptomycine.
- Transférer la rate et le milieu sur une crépine à cellules de 40 μm montée sur un tube conique de 50 mL. À l’aide de l’extrémité en caoutchouc d’un piston de seringue de 3 ml, écrasez doucement la rate. Lavez la crépine à cellules de 40 μm avec le média. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il ne reste que du tissu adipeux dans la crépine cellulaire de 40 μm. Rincez le tamis avec 3 à 5 ml de média pour augmenter la récupération cellulaire.
- Homogénat de la cellule de centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT. Après la centrifugation, jeter le surnageant et ajouter 10 mL de 1 tampon de lyse des globules rouges à la pastille. Pipetez de haut en bas, laissez agir 2 à 3 min à RT, puis centrifugez à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Jetez le surnageant et remettez en suspension les splénocytes appauvris en globules rouges dans 10 mL de milieu. Déterminer le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un autre appareil de comptage cellulaire. Granuler les cellules par centrifugation comme décrit ci-dessus.
REMARQUE : La concentration finale idéale nécessaire pour le chargement des splénocytes en Indo-1 est de 10 à 20 x 106 cellules/mL, mais une concentration plus faible de cellules peut être utilisée.
- Mettre en suspension les splénocytes à 15 x 106 cellules/mL dans un tampon de charge de flux calcique (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 milieu contenant 1 % de FCS, 10 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinesulfonique (HEPES), 1 mM de chlorure de magnésium (MgCl2), 1 mM d'éthylène glycol-bis(β-éther aminoéthylique)-N, N, N, N'-acide tétraacétique (EGTA) et 5 % de pénicilline-streptomycine). Ajoutez 1,5 μM d’Indo-1 à partir d’une solution mère de DMSO de 1 mM et retournez le tube plusieurs fois pour mélanger. Protéger de la lumière et incuber les cellules à 37 °C au bain-marie pendant 30 min.
- Après l’incubation de 30 minutes, ajoutez 5 fois la quantité de tampon de charge de flux de calcium. Centrifugeuse à 300 x g pendant 7 min à RT.
- Pour le contrôle sur les cellules B, colorez les cellules avec 1:200 anti-souris CD5-PE et anti-souris 1:200 B220-PE/Cy7 dans 0,5 mL de tampon de charge à 4 °C pendant 20 min, à l’abri de la lumière.
- Laver les splénocytes dans un tampon de charge de flux de calcium et centrifuger à 300 x g pendant 7 min à RT. Remettre en suspension les cellules à 10–20 x 106 cellules/mL dans un tampon de flux de calcium (solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 1 % de FCS, 1 mM de MgCl2 et 1 mM de chlorure de calcium (CaCl2)). Conserver sur de la glace, à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’il soit prêt à fonctionner sur le cytomètre en flux.
- Configurez la cytométrie en flux avec des contrôles non colorés et monocolores pour la compensation.
- Exécutez les cellules colorées pour configurer les vannes de manière appropriée (voir Figure 1A). Configurez le tracé Indo-1 (violet) versus Indo-1 (bleu), ajustez les tensions dans les canaux Indo-1 pour placer la coloration des cellules à une pente de 45 à 60° afin de maximiser le rapport signal/bruit de l’Indo-1 violet : bleu changement de rapport après stimulation des cellules B.
REMARQUE : Assurez-vous que les tensions ne sont pas trop élevées, de sorte qu’un pourcentage significatif des cellules (>5 %) soient contre le haut du graphique.
- Créez une porte diagonale qui encapsule la partie supérieure gauche (Violet+Bleu-) du graphique, de sorte que sans stimulation, <10 % des cellules se trouvent dans la porte, qui devrait idéalement augmenter à >75 % après la stimulation.
- Ajoutez 0,5 ml de cellules dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml (tube de tri cellulaire activé par fluorescence [FACS]) et réchauffez les cellules à 37 °C pendant 3 à 5 minutes dans un bain-marie. Placez le tube FACS dans la chambre à chemise d’eau à 37 °C qui est reliée à un bain-marie à recirculation.
- Faites fonctionner le tube dans la chemise d’eau du cytomètre en flux et lancez l’acquisition, sans stocker les données, à environ 5 000 à 10 000 événements/s. Une fois que les cellules se sont stabilisées (15 à 30 s), lancez l’acquisition des données et collectez les données pendant au moins 10 s pour établir l’arrière-plan.
- À la marque de 10 morve, retirez rapidement le tube du cytomètre en flux, ajoutez la stimulation (liposomes antigéniques 5-50 μM dans 2-20 μL), le vortex d’impulsion et remettez le tube FACS sur le cytomètre en flux. Maintenez l’acquisition et le stockage des données pendant cette période et collectez les données pendant 3 à 5 minutes.
- Analyser les données dans un logiciel d’analyse approprié sous les fonctions cinétiques.
Tableau 1 : Calculs pour la création d’un liposome de concentration totale en lipides de 1,25 μM.Exemple de tableau de calcul pour les liposomes de fragments IgM F(ab) anti-souris de chèvre.
| Mw | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | cholestérol | PEG-DSPE | excès de PEG-DSPE | aIgM-PEG-DSPE | total |
| Rapport molaire | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100,00 |
| Masse (mg) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| mmol | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1,25 |
| Ml | 112,50 | 45,93 | 70,64 | 0,00 | 525,97 | 755.03 |
| | | Conc. (mg/mL) | | | |
| | DSPC | 5 | | | |
| | cholestérol | 4 | | | |
| | PEG-DSPE | deux | | | |
| | aIgM-PEG-DSPE | 0,114 | | | |
