Concentration de protéines de filtrat de culture bactérienne à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration

Résumé

Source : Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Enrichissement des vésicules extracellulaires par chromatographie d’exclusion stérique. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Cette vidéo montre l’isolement et la concentration de protéines de filtrat de culture bactérienne, qui comprennent des vésicules extracellulaires bactériennes, à l’aide de l’ultrafiltration. Les vésicules extracellulaires concentrées servent de marqueurs diagnostiques pour la détection des maladies.

Protocole

1. Préparation du concentré brut de vésicules extracellulaires (VE) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

REMARQUE : Pour des procédures détaillées sur la culture de Mtb et la préparation de la protéine de filtrat de culture (CFP). Il est recommandé que les milieux de culture bactérienne soient exempts de suppléments de croissance contenant des composants contenant des VE ou des composants protéiques, tels que l’albumine oléique et la catalase (OADC), et de détergents tels que Tween. Il est également recommandé de dépister la qualité de la culture bactérienne et la CFP récoltée afin de limiter la mort cellulaire et la lyse.

1. Préparez un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa (voir le tableau des matériaux) en ajoutant la capacité volumique totale de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS). Centrifugeuse pendant 5 min à 2 800 x g à 4 °C.
   REMARQUE : Si vousutilisez un filtre sans volume d’arrêt mort, des précautions doivent être prises pour s’assurer que le volume de l’échantillon ne diminue pas en dessous du niveau du filtre, ce qui entraîne un séchage complet du filtre pendant la centrifugation.
2. Jetez le flux continu et tout PBS restant avant de remplir la chambre d’échantillonnage avec Mtb CFP à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 x g à 4 °C jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimum de l’appareil d’ultrafiltration. Répétez l’opération si nécessaire, en ajoutant plus de CFP à l’unité jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit.
   note: Conserver une partie du matériau à flux continu de 100 kDa (100F) pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.
3. Ajoutez 1x PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit au point 1.2. Répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage et un remplacement complets de la mémoire tampon.
4. Récupérer le rétentat CFP concentré de 100 kDa (100R) selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration (voir Tableau des matériaux). Une fois le 100R récupéré, lavez le filtre avec un volume minimal de 1x PBS au moins trois fois, et mettez le lavage en pool avec le 100R pour maximiser la récupération.
5. Quantifier le matériau 100R à l'aide d'un test bicinchoninique (ACB) en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour effectuer le test, utilisez plusieurs dilutions d’échantillons 1:2, 1:5 et 1:10 dans du PBS. Testez l’échantillon dans triplicate.
   note: Conservez une partie du matériau 100R pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collecteur automatique de fractions	La science IZON	AFC-V1-USD
Centricon Plus - Filtre centrifuge 70, coupure 100 kDa	Millipore Sigma	UFC710008	Dispositif d’ultrafiltration utilisé à l’étape 1.1
Saline tamponnée au phosphate, 1X sans calcium ni magnésium	Corning	Référence 21-040-CV
Membrane nitrocellulosique, rouleau, 0,2 μm	BioRad	1620112