1. Préparation du concentré brut de VTT EV
REMARQUE : Pour des procédures détaillées sur la culture de Mtb et la préparation de la protéine de filtrat de culture (CFP), voir Références. Il est recommandé que les milieux de culture bactérienne soient exempts de suppléments de croissance contenant des composants contenant des VE ou des composants protéiques, tels que l’albumine oléique et la catalase (OADC), et de détergents tels que Tween. Il est également recommandé de dépister la qualité de la culture bactérienne et la CFP récoltée afin de limiter la mort cellulaire et la lyse.
- Préparez un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa (voir le tableau des matériaux) en ajoutant la capacité volumique totale de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS). Centrifugeuse pendant 5 min à 2 800 x g à 4 °C.
note: Si vous utilisez un filtre sans volume d’arrêt mort, il faut veiller à ce que le volume de l’échantillon ne diminue pas en dessous du niveau du filtre, ce qui entraîne un séchage complet du filtre pendant la centrifugation.
- Jetez le flux continu et tout PBS restant avant de remplir la chambre d’échantillonnage avec Mtb CFP à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 x g à 4 °C jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimum de l’appareil d’ultrafiltration. Répétez l’opération si nécessaire, en ajoutant plus de CFP à l’unité jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit.
note: Conserver une partie du matériau à flux continu de 100 kDa (100F) pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.
- Ajoutez 1x PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit au point 1.2. Répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage et un remplacement complets de la mémoire tampon.
- Récupérer le rétentat CFP concentré de 100 kDa (100R) selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration (voir Tableau des matériaux). Une fois le 100R récupéré, lavez le filtre avec un volume minimal de 1x PBS au moins trois fois, et mettez le lavage en pool avec le 100R pour maximiser la récupération.
- Quantifier le matériau 100R à l'aide d'un test bicinchoninique (ACB) en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour effectuer le test, utilisez plusieurs dilutions d’échantillons 1:2, 1:5 et 1:10 dans du PBS. Testez l’échantillon dans triplicate.
note: Conservez une partie du matériau 100R pour la qualification en aval si vous le souhaitez. Conserver à 4 °C.
2. Chromatographie d’exclusion stérique pour l’enrichissement des VE VTT à partir de CFP
REMARQUE : La procédure suivante est spécifique à l’utilisation de 3 mg de 100R Mtb CFP avec colonne SEC et collecteur automatique de fractions (AFC, voir Tableau des matériaux). Il peut être adapté à d'autres concentrations de départ et types de colonnes en suivant les spécifications du fabricant. De plus, il est recommandé aux utilisateurs de lire et de comprendre le manuel d’utilisation du collecteur automatique de fractions.
- Laissez la colonne SEC s’équilibrer à la température ambiante.
- Allumez l’AFC à l’aide de l’interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’unité tour et ajustez les paramètres de la cellule de charge, si nécessaire, en appuyant sur SETUP sur l’écran tactile du menu principal. Le capteur de pesage ne doit être étalonné qu’à la première utilisation, après chaque mise à jour du logiciel, et si une incohérence dans les volumes de collecte de fractions est remarquée.
- À partir de l’écran CONFIGURATION, alignez le carrousel en sélectionnant CARROUSEL > CALIBRER. Insérez le carrousel avec les 13 petits trous orientés vers le haut dans la tour AFC et ajustez le carrousel de sorte que la buse de fluide soit directement au-dessus de la position affleurante en appuyant sur les boutons - et/ou +.
- Retirez les capuchons de la colonne SEC équilibrée. Faites glisser la colonne SEC dans le support de colonne approprié et installez-la soigneusement sur la tour AFC. Assurez-vous que l’étiquette d’identification par radiofréquence (RFID) sur la colonne fait face à l’AFC et vérifiez que la connexion entre la colonne et la vanne est sécurisée. Placez le tube de sortie des déchets dans un récipient de collecte.
- À partir de l’écran CONFIGURATION, sélectionnez Programme de collecte et réglez le compte à 13 et la taille à 0,5 ml en appuyant sur les boutons - et/ou +. Laissez le paramètre « Volume tampon » par défaut de 2,7 ml, puis fermez la fenêtre « Calendrier de collecte » en appuyant sur X.
- Sélectionnez DÉMARRER LA COLLECTE sur l’écran d’accueil et confirmez les paramètres de collecte en sélectionnant OUI. Chargez 13 tubes de microcentrifugation de 1,7 ml étiquetés avec les couvercles ouverts et pointant vers le centre du carrousel.
- Faites avancer l’AFC en sélectionnant OK, puis montez le réservoir de colonne et avancez à nouveau en appuyant sur OK. Sélectionnez l’option permettant de vider la colonne en appuyant sur YES et d’ajouter un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 μm pour supprimer tout tampon de stockage. Une fois le vidage terminé, faites avancer l’AFC en appuyant sur OK.
- Placez le couvercle du carrousel sur l’AFC et appuyez sur OK. Préparez un volume de colonne de PBS filtré de 0,2 μm. À l’aide d’une pipette, retirez tout excès de tampon de la colonne.
- Apportez 3 mg d’échantillon 100R tel que quantifié à l’étape 1,5 à 500 μL avec 1x PBS. Ajouter l’échantillon de 3 mg dans le haut de la colonne. Avancez l’AFC et laissez l’échantillon s’écouler dans la fritte. Une fois que l’échantillon est complètement entré dans la colonne, ajoutez le PBS préparé à l’étape 2.6 dans le réservoir.
- Surveillez le fonctionnement de l’AFC pendant qu’il collecte d’abord le volume de vide, puis les fractions spécifiées. Une fois le parcours terminé et le carrousel de retour en position de déchet, retirez le couvercle et retirez les tubes de fraction du carrousel. Stocker les fractions à 4 °C avant la quantification (étape 3) et la qualification (étape 4).
- Si la colonne doit être réutilisée, sélectionnez l’option de nettoyage de la colonne en appuyant sur OUI ; sinon, appuyez sur NON. Suivez les instructions sur le fichier AFC.
REMARQUE : Une fois que la colonne est lavée et que la mémoire tampon de stockage est épuisée, elle peut être retirée, bouchée et stockée à 4 °C.
