Une technique zWEDGI pour visualiser les larves de poisson-zèbre infectées par des agents pathogènes fongiques

Résumé

Source : Thrikawala, S. et al., Infection des larves de poisson-zèbre par des spores d’Aspergillus pour l’analyse des interactions hôte-pathogène.J. Vis. Exp.(2020)

La vidéo montre une technique de dispositif de blessure et de piégeage de poisson-zèbre pour observer l’infection par des agents pathogènes fongiques marqués par fluorescence chez les larves de poisson-zèbre. L’infection initiale attire les macrophages et, à mesure que l’infection persiste, le recrutement des neutrophiles progresse au site d’injection.

Protocole

1. Préparation des spores d’Aspergillus pour injection

1. À partir d’une suspension de spores d’Aspergillus, calculez le volume nécessaire pour obtenir 1 x 10⁶ spores. Le volume doit être de 20 à 100 μL ; sinon, produire une dilution de 10x dans du Tween-20 stérile à 0,01 % (v/v) (Tween-water ; Table des matériaux). Par exemple, si le volume calculé est de 5 μL, produire une dilution 10x et utiliser 50 μL de la solution diluée.
   note: Deux plaques/souches peuvent être préparées pour recueillir plus de spores ou comme solution de rechange en cas de contamination.
2. Étalez 1 x 10⁶ spores d’Aspergillus sur une plaque de milieu minimal de glucose (GMM) (Table des matériaux) avec un épandeur stérile jetable en forme de L dans une enceinte de biosécurité. Évitez de l’étaler sur le bord de l’assiette. Incuber à 37 °C pendant 3 à 4 jours, l’assiette à l’envers.
3. Le jour de la collecte, apportez du miracloth stérile et des tubes coniques de 50 mL (deux par souche), des bouteilles fraîches d’eau stérile Tween (une par souche) et des épandeurs stériles jetables en forme de L dans l’enceinte de biosécurité.
   note: Miracloth peut être coupé en ~8 po x 6 po en morceaux, enveloppé dans du papier d’aluminium et autoclavé pour être stérilisé.
4. Placez un morceau de miracloth dans chaque tube conique de 50 ml étiqueté et rebouchez-le. Sortez le paquet de miracloth restant de la capuche.
5. Apportez les plaques dans l’enceinte de biosécurité. Ouvrez une assiette, puis versez de l’eau Tween sur le dessus pour couvrir environ les trois quarts de l’assiette.
6. À l’aide d’un écarteur jetable en forme de L, grattez doucement la surface de la culture fongique dans un mouvement de va-et-vient, tout en utilisant l’autre main pour faire pivoter la plaque. Grattez jusqu’à ce que presque toutes les spores soient homogénéisées dans l’eau de l’entrejama.
   note: En raison de leur hydrophobicité élevée, les spores peuvent créer des « bouffées » lorsque de l’eau Tween est ajoutée ou pendant le grattage. Il faut prendre grand soin d’éviter de contaminer les tubes ou les plaques à proximité. Il est conseillé de changer de gants et d’essuyer la surface avec de l’éthanol à 70 % entre l’extraction des différentes souches.
7. Prenez un tube conique de 50 ml et retirez le morceau de miracloth. Pliez-le en deux et faites-en un filtre inséré dans le haut du tube conique de 50 ml.
8. Versez l’homogénat fongique de la plaque sur le miracloth dans le tube.
   note: Si deux plaques d’une souche sont préparées, grattez les deux plaques et versez-les dans le même tube conique.
9. Versez de l’eau Tween pour porter le volume total dans le tube conique à 50 mL.
10. Faites tourner à 900 x g pendant 10 min. Assurez-vous d’utiliser des bouchons anti-aérosolisation dans la centrifugeuse.
11. Versez le surnageant dans une solution d’eau de Javel à ~10 % pour décontaminer. Versez 50 ml de solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube conique, puis agitez ou agitez pour remettre la pastille en suspension.
12. Essorer à nouveau à 900 x g pendant 10 min. Verser le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de 1x PBS stérile. Filtrer à travers un morceau de miracloth frais dans un tube conique frais de 50 ml.
13. Effectuer des dilutions en série de 10 fois (10x, 100x, 1000x) de l’homogénat fongique dans des tubes à centrifuger de 1,7 mL (p. ex., pour la solution 10x, mélanger 100 μL de l’homogénat fongique avec 900 μL d’eau Tween-water).
14. Choisissez la première dilution dans laquelle les spores ne sont pas visibles lorsqu’elles sont déchargées dans l’eau de préadolescence et utilisez cette dilution pour compter le nombre de spores à l’aide d’un hémocytomètre.
15. Calculer la concentration de spores dans l’homogénat fongique préparé (suspension dans l’eau) à l’aide de la formule suivante :
    Concentration (spores/mL) = Nombre de spores dans les 25 boîtes du milieu x facteur de dilution x 10⁴
16. Préparez un stock de 1 mL de 1,5 x 10⁸ spores/mL dans du 1x PBS stérile dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Cette préparation de spores peut être conservée à 4 °C pendant ~4 semaines.
17. Avant l’utilisation dans les injections, mélanger 20 μL de la préparation de spores avec 10 μL de rouge de phénol stérile à 1 % dans un tube à centrifuger de 1,7 mL pour obtenir une concentration finale de spores de 1 x 10⁸ spores/mL. Vortex soigneusement avant l’injection.
    REMARQUE : La solution de rouge de phénol à 1 % doit être stérilisée par filtre et stockée dans des aliquotes.
18. Pour une injection fictive, mélanger 20 μL de 1x PBS avec 10 μL de rouge de phénol stérile à 1
 %.

2. Préparation des plaques de gélose pour l’injection

1. Préparez de l’agarose à 2 % dans un milieu E3 et faites-le fondre au micro-ondes.
2. Verser dans une boîte de Pétri de 100 mm x 15 mm (~25 ml par assiette), agiter pour couvrir uniformément l’assiette et laisser refroidir.
3. Enveloppez la plaque d’un film de paraffine et conservez-la à 4 °C à l’envers.
4. Avant l’injection, amenez la plaque à température ambiante (RT).
5. Versez ~1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % stérilisée par filtre sur la plaque, inclinez la plaque pour étaler et couvrir tout le fond, et rincez avec E3.
   REMARQUE : La solution de BSA à 2 % peut être stérilisée par filtre et stockée sous forme d’aliquotes de 1 mL à -20 °C. Le prétraitement de BSA à 2 % empêche les larves de coller à la surface de l’agarose.
6. Versez E3 avec de la tricaïne tamponnée sur la plaque et laissez-le reposer jusqu’à l’injection.

3. Micro-injection du ventricule postérieur de la larve de poisson-zèbre

1. Déchorionner manuellement les larves à l’aide d’une pince à 2 dpf dans une boîte de Pétri.
   note: La déchorionation peut être effectuée à tout moment à partir de 1,5 dpf jusqu’au moment de l’injection.
2. Retirer la plus grande quantité possible d’E3 de la boîte de Pétri et ajouter 300 μg/mL de tricaïne tamponnée dans l’E3 pour anesthésier les larves.
   note: Une solution mère de tricaïne tamponnée à 4 mg/mL dans E3 peut être préparée et conservée à 4 °C. La solution de travail peut être préparée en diluant 4 mL de la solution mère jusqu’à 50 mL avec E3.
3. Utilisez une configuration de micro-injection fournie avec l’injecteur de pression, l’unité de contre-pression, la pédale, le support de micropipette, le micromanipulateur et un support et une plaque magnétiques, tous connectés à une source d’air comprimé (Tableau des matériaux).
4. Ouvrez la vanne d’air comprimé et allumez le micro-injecteur. Réglez la pression sur ~25 PSI, la durée d’impulsion sur 60 ms et l’unité de contre-pression sur 1 livre par pouce carré (PSI).
5. Chargez une aiguille de micro-injection à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur (Table des matériaux) avec environ 3 à 5 μL de PBS préparé ou une suspension de spores avec du rouge de phénol. Montez l’aiguille sur le micromanipulateur.
   note: Les aiguilles de micro-injection peuvent être préparées comme décrit précédemment. Le stéréomicroscope utilisé pour les micro-injections doit être doté d’un réticule oculaire pour calibrer l’aiguille de micro-injection. Le réticule doit être calibré à l’aide d’un micromètre de platine et la longueur de l’échelle du réticule (μm) doit être déterminée. Le diamètre de la goutte de suspension de spores qui s’éjecte de l’aiguille est mesuré en fonction du nombre de hachages (du réticule) qui se chevauchent avec la goutte.
6. Positionnez le micromanipulateur de manière à ce que l’extrémité de l’aiguille soit visible au grossissement le plus faible sous le stéréomicroscope. Zoomez à un grossissement de 4x, en gardant l’aiguille en vue.
7. À l’aide d’une pince bien aiguë, coupez l’extrémité de l’aiguille. Appuyez sur la pédale d’injection pour visualiser la taille de la gouttelette qui en sort. Continuez à couper jusqu’à ce que ~3 nL de suspension de spores soient injectés (ici, il s’agit de cinq hachages).
8. Écartez le micromanipulateur et l’aiguille pour éviter de heurter accidentellement l’aiguille pendant que les larves sont disposées sur la plaque d’injection.
9. Versez l’E3-Tricaïne de la plaque d’injection, puis transférez ~24 larves anesthésiées dans la plaque d’injection avec le moins d’E3 possible à l’aide d’une pipette de transfert.
10. À l’aide d’un petit outil pour manipuler les larves de poisson-zèbre (c’est-à-dire un outil de boucle de cheveux ou un outil pour cils), disposez les larves en fonction de la direction dans laquelle elles font face. Plus précisément, placez tous ceux qui font face à droite dans une rangée, et tous ceux qui font face à gauche dans une rangée en dessous.
    note: Cette disposition est difficile s’il y a trop de liquide sur la plaque, car les larves « flotteront » hors de leur place. Cependant, un manque de liquide est également problématique si les injections prennent beaucoup de temps, car les larves peuvent se dessécher ou l’anesthésie s’estomper. Ainsi, une attention particulière doit être portée à la quantité de liquide sur la plaque tout au long du processus de micro-injection.
11. Réglez le zoom du microscope sur le grossissement le plus faible. Ramenez le micromanipulateur et disposez-le de manière à ce que l’aiguille soit proche des larves, à un angle de ~30° à 60°, au milieu du champ de vision.
12. Zoomez sur le grossissement le plus élevé et utilisez des boutons de réglage précis pour ajuster davantage la position de l’aiguille. Vérifiez que ~30 à 70 spores sortent de l’aiguille en injectant la suspension de spores dans le liquide sur la plaque à côté des larves. Ajustez le temps et la pression sur la configuration de l’injection, si nécessaire.
    note: Ce test doit être répété toutes les cinq à six larves, car le nombre de spores sortant de l’aiguille peut augmenter ou diminuer avec le temps.
13. En commençant par la rangée dans laquelle les larves font face à l’aiguille, déplacez la plaque de manière à ce que l’aiguille soit directement au-dessus et positionnée près des premières larves.
14. En déplaçant l’aiguille à l’aide du micromanipulateur, insérez l’aiguille dans le tissu autour de la vésicule otique pour percer dans le ventricule du cerveau postérieur. Déplacez la plaque avec l’autre main si nécessaire pour obtenir la bonne orientation de la larve avec l’angle de l’aiguille.
15. Vérifiez visuellement que l’extrémité de l’aiguille se trouve au centre du ventricule du cerveau postérieur, appuyez sur la pédale pour injecter les spores et rétractez doucement l’aiguille.
    note: Le colorant rouge phénol doit principalement rester dans le ventricule du cerveau postérieur. Une petite quantité peut aller dans le mésencéphale, mais elle ne doit pas atteindre le cerveau antérieur ou l’extérieur du cerveau. Si c’est le cas, le volume injecté est trop important, et la pression et le temps doivent être diminués en conséquence, ou une nouvelle aiguille doit être calibrée.
16. En descendant dans la plaque, injectez toutes les larves de cette rangée. Ensuite, retournez la plaque et injectez toutes les larves dans l’autre rangée.
    note: Les larves injectées sans succès ou accidentellement endommagées peuvent être marquées par 1) l’injection dans le jaune à quelques reprises pour créer une marque rouge ou 2) le fait de traîner la larve hors de la rangée avec l’aiguille.
17. Déplacez l’aiguille vers le haut et écartez-vous à nouveau. Faites un zoom arrière sur le microscope pour obtenir un grossissement plus faible. Le colorant rouge phénolique doit toujours être visible dans le cerveau postérieur de chaque larve.
18. Tout d’abord, tirez avec un outil de boucle de cheveux et pipetez pour éliminer les larves dont les injections ont échoué. Transférez les larves restantes dans une nouvelle boîte de Pétri en les lavant de la plaque avec de l’E3 frais et stérile et une pipette de transfert.
19. Répéter l’opération au besoin pour obtenir le numéro d’échantillon expérimental final souhaité.
20. Rincez les larves au moins 2 fois avec de l’E3 et assurez-vous de la récupération de l’anesthésie.
21. Pour quantifier la survie sans autre traitement, à l’aide d’une pipette de transfert, transférez les larves dans une plaque de 96 puits (1 larve par puits) dans E3.

4. Établissement du nombre de spores injectées et viables

1. Immédiatement après l’injection, à l’aide d’une pipette de transfert, prélevez au hasard environ huit des larves injectées et transférez-les dans des tubes à centrifuger de 1,7 ml (une larve par tube).
2. Euthanasier les larves avec de la tricaïne ou en les plaçant à 4 °C pendant 0,5 à 2,0 h.
3. Préparez 1 mL d’ampicilline à 1 mg/mL et de 0,5 mg/mL de solutions antibiotiques de kanamycine dans du PBS stérile 1x. La solution restante peut être conservée à 4 °C et utilisée plus tard.
   note: Les solutions mères d’ampicilline à 100 mg/mL et de kanamycine à 50 mg/mL peuvent être préfabriquées, stérilisées par filtre et stockées dans des aliquotes à -20 °C. Diluez-les 100x dans 1x PBS pour obtenir la solution de travail.
4. À l’aide d’une pipette, prélevez autant de liquide que possible du tube de centrifugation, en laissant la larve derrière vous, et ajoutez 90 μL du 1x PBS avec antibiotiques.
   note: Les antibiotiques sont utilisés pour prévenir la croissance bactérienne dans les plaques GMM qui peuvent interférer avec le comptage des colonies d’Aspergillus.
5. Homogénéiser les larves dans un lyseur tissulaire à 1 800 oscillations/min (30 Hz) pendant 6 min. Tourner vers le bas à 17 000 x g pendant 30 s.
6. Étiqueter les plaques GMM (une plaque par larve homogénéisée). À l’aide d’un bec Bunsen pour créer un environnement stérile, pipetez la suspension homogénéisée d’un tube au milieu de la plaque GMM, puis étalez-la à l’aide d’un épandeur jetable en forme de L. Évitez d’étaler l’homogénat contre le bord.
7. Incuber les plaques à l’envers à 37 °C pendant 2 à 3 jours et compter le nombre de colonies formées, unité formant colonie (UFC).
8. Pour mesurer le nombre de spores vivantes pendant la période d’infection, prélevez les larves dans les plaques de 96 puits 1 à 7 jours après l’injection (dpi) et transférez-les dans des tubes à centrifuger. Euthanasier et homogénéiser les larves pour les disperser sur des plaques de MGM comme décrit aux étapes 4.1 à 4.5.

5. Traitement médicamenteux des larves injectées

1. Après la section 4, répartissez les larves injectées restantes dans deux boîtes de 3,5 mm : une pour le traitement médicamenteux et une pour le contrôle. Utilisez environ 24 larves infectées par condition.
   note: Les plats de 3,5 mm peuvent être traités avec 2 % de lait écrémé en poudre dans l’eau, rincés, séchés à l’air et stockés au préalable à RT. L’enrobage de lait empêchera les larves de coller au plastique.
2. Préparez la solution médicamenteuse souhaitée et le véhicule en E3 sans bleu de méthylène dans des tubes coniques selon la concentration finale requise, puis mélangez bien. Par exemple, pour surveiller la survie des larves exposées à la dexaméthasone, utilisez 24 larves (répétitions) pour la dexaméthasone et 24 pour le contrôle des véhicules, comme le diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparez 5 mL de la solution médicamenteuse à la concentration requise. Ici, 5 mL de DMSO à 0,1 % et 10 μM de dexaméthasone ont été utilisés, et 24 larves/affection ont été transférées à ~200 μL du véhicule/solution médicamenteuse/larves.
3. Retirez autant de liquide que possible d’une boîte à l’aide d’une pipette de transfert et ajoutez du E3 prémélangé contenant le contrôle du véhicule. Répétez l’opération avec du E3 prémélangé contenant le traitement d’intérêt pour l’autre plat.
4. À l’aide d’une pipette, transvaser les larves dans une plaque de 96 puits (une larve par puits). Surveiller la survie des larves injectées exposées au véhicule ou au médicament pendant 7 jours.
   note: Le médicament peut être appliqué uniquement le jour de l’infection et conservé sur les larves pendant toute la durée de l’expérience ou peut être rafraîchi quotidiennement.

6. Imagerie quotidienne des larves infectées à l’aide du dispositif de blessure et de piégeage du poisson-zèbre pour la croissance et l’imagerie (zWEDGI)

1. S’assurer que les larves sont traitées avec 100 μM de N-phénylthiourée (PTU) à 24 hpf pour prévenir la pigmentation et que le PTU est conservé sur les larves pendant toute la durée de l’expérience.
   note: La PTU à 75–100 μM empêche la pigmentation des larves sans aucun défaut de développement macroscopique. Cependant, le PTU peut interférer avec certains processus biologiques, et les chercheurs doivent déterminer à l’avance si le médicament peut affecter les processus à l’étude.
2. Infecter les larves transgéniques avec des populations cellulaires marquées d’intérêt à 2 dpf avec des spores d’Aspergillus modifiées pour exprimer une protéine fluorescente, comme décrit dans la section 3. Ensuite, transférez les larves infectées dans des puits d’une plaque de 48 puits dans environ 500 μL/puits d’E3 sans bleu de méthylène.
   note: Une plaque à 48 puits est utilisée ici car il est plus facile de transférer les larves dans et hors lors d’une imagerie quotidienne répétée.
3. Le jour de l’imagerie, préparez deux boîtes de Pétri de 3,5 mm : l’une avec 100 μM PTU et l’autre avec de la E3-tricaïne.
4. Ajoutez de l’E3-tricaïne dans les chambres d’un appareil zWEDGI. Sous le stéréomicroscope, retirez les bulles d’air des chambres et du canal de retenue à l’aide d’une micropipette P100. Retirez tout l’excès de E3-tricaïne, de sorte qu’il ne se trouve que dans les chambres.
5. Pipeter une larve de la plaque à l’aide d’une pipette de transfert. Si vous utilisez beaucoup de liquide pour l’enlever, pipetez-le dans une boîte de 3,5 mm contenant du E3-PTU. Ensuite, pipetez à nouveau, en utilisant le moins de liquide possible, et transférez dans la tricaïne E3.
6. Attendre ~30 s pour l’anesthésie, puis transférer dans la chambre de chargement du dispositif de blessure et de piégeage (par exemple, zWEDGI).
7. Sous le stéréomicroscope, positionnez la larve. À l’aide de la micropipette P100, vous pouvez retirer la tricaïne E3 de la chambre de blessure et la relâcher dans la chambre de chargement afin de déplacer la queue de la larve dans le canal de restriction. Assurez-vous que la larve est positionnée sur son côté latéral, dorsal ou dorsolatéral afin que le cerveau postérieur puisse être imagé avec une lentille d’objectif inversée.
8. Imagez les larves à l’aide d’un microscope confocal.
9. Après l’imagerie, à l’aide de la pipette P100, libérez la tricaïne E3 dans la chambre de blessure pour pousser la larve du canal de retenue dans la chambre de chargement.
10. À l’aide d’une pipette de transfert, prélevez la larve et transférez-la dans la boîte de Pétri avec E3-Tricaïne. En utilisant le moins de liquide possible, transférez-le dans la boîte de Pétri avec E3-PTU. Rincer dans du PTU et transférer à nouveau dans la plaque à 48 puits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince Dumont #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
Réticule de l’oculaire	Le monde des microscopes	RETR10	Pour calibrer les aiguilles, utilisé en stéréomicroscope
Configuration du micro-injecteur : Unité de contre-pression	Instrumentation scientifique appliquée	Le
Pédale de commande	Instrumentation scientifique appliquée	FTSW
Kit de porte-micro-pipette	Instrumentation scientifique appliquée	M-Pip
Injecteur de pression	Instrumentation scientifique appliquée	MPPI-3
Configuration du micromanipulateur : Micromanipulateur	Narashige (Tritech)	M-152
Support et plaque magnétiques	Tritech	MINJ-HBMB
Extracteur d’aiguille	Instrument Sutter	P-97
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	Référence 85300	Pour homogénéiser les larves
matériel
Agarose	pêcheur	BP160-500
Sel d’ampicilline sodique	pêcheur	AAJ6380706
BSA, fraction V	VWR	AAJ65855-22
Sulfate de kanamycine	pêcheur	AAJ1792406
Épandeurs en L	pêcheur	14 665 230
Aiguilles microcapillaires (sans filament)	World Precision Instruments (WPI)	TW100-3
Pointes de pipette à microchargeur	VWR	Référence 89009-310	Pour charger l’aiguille avec la suspension Aspergillus
Tissu Miracloth	VWR	EM475855-1R	Pour filtrer la suspension d’Aspergillus
N-phénylthiourée	pêcheur	AAL0669009	Pour prévenir la pigmentation
Rouge de phénol, solution à 1 %	pêcheur	Référence 57254
Tricaïne (3-aminobenzoate d’éthyle, sel d’acide méthanesulfonique)	pêcheur	AC118000500	Pour anesthésier les larves
Préadolescent-20	pêcheur	Réf. BP337-500
Médias et solutions			Composants/Recette
Média E3 : 60x E3			17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 4,9 g de MgSO4 · 7H2O, à 1 L avec H2O
1x E3			16,7 ml de crosse 60x, 430 ul 0,05 M NaOH, à 1 L avec H2O (en option : + 3 ml de bleu de méthylène 0,01 %)
Solution mère de tricaïne			2 g de tricaïne, 5 g de Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml 60X E3, à 500 ml avec H2O, pH à 7,0-7,5 avec NaOH
Gélose à milieu minimal de glucose (MGM) : gélose GMM			10 g de glucose (dextrose), 50 ml 20x sels de nitrate, 1 ml de TE, à 1 L avec H2O, pH à 6,5 avec NaOH, + 16 g de gélose, autoclave
20x Sels de nitrate			120 g de NaNO3, 10,4 g de KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, à 1 L avec H2O, autoclave
Oligo-éléments (TE)			2,20 g de ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g de H3BO3, 0,50 g de MnCl2 · 4H2O, 0,16 g de FeSO4 · 7H2O, 0,16 g de CoCl2 · 6H2O, 0,16 g de CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g de Na2EDTA, à 100 ml avec H2O, dissoudre en agitant pendant la nuit, autoclave