La technique de photoconversion pour explorer la dynamique cellulaire inflammatoire dans les pupes d’insectes

Abstract

Source : Weavers, H. et al., Suivi in vivo à long terme de la dynamique des cellules inflammatoires au sein des pupes de drosophile.J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo démontre l’utilisation de la photoconversion pour étudier la dynamique cellulaire inflammatoire chez les pupes de drosophile. Les hémocytes verts sont attirés vers l’épithélium blessé, suivis d’une migration à distance. La photoconversion fait passer certains hémocytes du vert au rouge, facilitant ainsi le suivi de leurs mouvements.

Protocol

Ce protocole comprend quatre étapes séquentielles principales : (1) Préparation des stocks de drosophiles et stadification des pupes de drosophile, (2) Dissection et montage de la nymphe, (3) Blessure de la nymphe, (4) Imagerie confocale time-lapse in vivo.

1. Préparation des stocks de drosophile et stadification des pupes

1. Procurez-vous des stocks appropriés de drosophiles (voir Introduction et Tableau des matières).
2. Prélever des mouches adultes jeunes et en bonne santé du génotype approprié.
   1. Sélectionnez les mouches adultes à l’aide de coussinets de dioxyde de carbone pour anesthésier brièvement les mouches et d’un pinceau fin pour transférer les mouches du génotype ou du sexe approprié dans un flacon de collecte.
   2. Ajouter 20 femelles vierges et 20 mâles dans chaque flacon contenant un milieu alimentaire standard pour mouches (un mélange de semoule de maïs-mélasse-agar, voir le tableau des matériaux) complété par de la levure.
3. Pour une génération optimale de nymphes, versez chaque jour les mouches adultes sur de nouveaux aliments dans des flacons frais, en maintenant tous les flacons à 25 °C
   note: Si le système Gal4-UAS (Gal4-UAS) est utilisé pour piloter l’expression génique spécifique à la lignée, toutes les étapes doivent être effectuées à 25 °C ou plus, car le système Gal4-UAS est sensible à la température.
4. 18 h avant la séance d’imagerie prévue, prélever au moins 10 pré-pupes blanches nouvellement formées (figure 1A) dans les flacons (c.-à-d. 0 h après la formation du puparium, FPA) à l’aide d’une pince ou d’un pinceau fin pour déloger les pupes de la surface intérieure du flacon et transférer soigneusement les pupes sur le côté d’un flacon en plastique vide et propre.
   note: Les larves errantes du 3e^stade rampent vers le haut hors du milieu alimentaire pour subir la nymphose ; Les prépupes blanches nouvellement formées sont facilement identifiables car elles possèdent des spiracles antérieurs éversés et sont stationnaires (contrairement aux larves du 3e stade). La cuticule se transforme en « pupadium » (la nymphe) qui est initialement molle et blanche. Il faut veiller à ne pas endommager les nymphes, car cela peut entraîner non seulement une réponse inflammatoire indésirable induite par une blessure, mais aussi un retard de développement important.
5. Ager les pupes sélectionnées jusqu’au stade de développement approprié (18 h d’APF donnera des résultats optimaux) dans le flacon à 25 °C.
   note: Au fur et à mesure que les pupes se développent, l’enveloppe nymphale deviendra progressivement plus foncée et plus cassante.
6. Préparez à l’avance d’autres réactifs pour l’étape suivante. Pour fabriquer la colle à l’heptane, mélangez une longueur de 20 cm de ruban adhésif double face enroulé avec 20 ml d’heptane dans un tube à centrifuger de 50 ml, scellez-le avec le film de paraffine et faites-le basculer à température ambiante pendant la nuit sur le banc.

2. Préparation et dissection des pupes de drosophile

1. Transférez les pupes de drosophile étagées sur un morceau de ruban adhésif double face monté sur une lame de verre. Positionnez les pupes de manière à ce que la face ventrale soit fermement collée au ruban et que la face dorsale soit tournée vers le haut (Figure 1B).
   note: L’antérieur de la nymphe sera identifiable à partir des deux spiracles qui dépassent de l’extrémité antérieure de la nymphe.
2. Retirer délicatement les pupes de leur enveloppe protectrice à l’aide d’un microscope de dissection à fond clair à l’aide d’une pince et de micro-ciseaux (figure 1B-D).
   1. Dans un premier temps, faites une incision dans la région la plus antérieure du puparium à l’aide de la pince (Figure 1B). Assurez-vous que l’étui nymphal dans cette zone est creux et dépourvu de tissu nymphal, car les pupes auront rétréci à l’intérieur de l’étui au cours du développement précoce de la nymphe.
   2. Après cette incision initiale, déchirez ou coupez soigneusement l’enveloppe de la nymphe dans le sens de l’avant vers l’arrière à l’aide d’une pince ou d’un microciseau (Figure 1C) jusqu’à ce que la nymphe soit complètement libérée de l’enveloppe cassante opaque et brune (Figure 1D).
      note: Les pupes à ce stade sont très fragiles et il faut veiller à ne pas perforer la surface de la nymphe ; La perforation est évidente car l’hémolymphe s’échappe rapidement du site de ponction. Les pupes avec des ponctuations, aussi petites soient-elles, doivent être jetées.
3. Montez les pupes dans un plat à fond de verre à l’aide de colle heptane.
   1. À l’aide d’une pointe de pipette de 20 ml, placez une goutte de 10 ml de colle heptane pré-préparée (voir section 1.6 ci-dessus) en une ligne sur le plat à fond de verre.
   2. Laissez sécher la colle pendant 5 secondes avant de transférer délicatement les pupes disséquées sur la colle à l’heptane à l’aide d’une pince (figure 1E).
   3. Pour faciliter les blessures et l’imagerie, alignez les pupes en rang ; environ 5 pupes sont suggérées, mais plus seront gérables avec l’expérience.
      note: L’utilisation de colle heptane est recommandée lors de l’utilisation de systèmes d’imagerie verticaux, mais n’est pas nécessaire lors de l’utilisation d’un système inversé. Si la colle crée des aberrations optiques pendant l’imagerie, les pupes peuvent être placées directement sur le couvre-objet à la place - l’adhérence naturelle entre le tissu nymphal et le verre sera suffisante dans la plupart des cas pour une imagerie stable, à condition de faire attention lors du déplacement de la boîte d’imagerie entre les microscopes.
4. Pour de meilleurs résultats, montez les pupes de manière à ce que l’aile soit à plat sur le couvre-objet et que la majorité de la surface de l’aile soit en contact direct avec le couvre-objet (figure 1F). Faites rouler les pupes à l’aide d’une pince pour changer leur position afin de vous assurer que l’aile est correctement montée.
5. Pour éviter la déshydratation de l’échantillon pendant la période d’imagerie, ajoutez un morceau de papier filtre absorbant trempé dans de l’eau distillée sur le côté de la boîte à fond de verre à la fin du montage, en prenant soin de ne pas déranger les pupes (figure 1E). Couvrez le plat avec un couvercle.
   note: Les pupes sont maintenant prêtes à être blessées et immatriculées.

3. Blessure par laser des ailes de nymphe de drosophile

1. Transférez la boîte à fond de verre contenant les pupes montées dans un microscope à grand champ équipé d’un système d’ablation laser accordable.
   1. Utilisez un laser d’ablation par pompage d’azote refroidi à l’air et à UV pulsé, réglé à 435 nm – voir le tableau des matériaux pour plus de détails ; la longueur d’onde précise de la lumière utilisée pour l’éclairage est sélectionnée par l’utilisateur via une cellule de colorant appropriée.
2. À l’aide d’une optique en fond clair, ajustez les commandes de la platine du microscope pour localiser l’aile de la nymphe de la première nymphe blessée (figure 1F).
3. Pour des résultats optimaux, utilisez une lentille d’objectif à immersion dans l’huile 40X ou 63X pour l’imagerie et l’ablation laser ; assurez-vous que le liquide d’immersion utilisé (huile ou glycérol) est cohérent entre les systèmes d’ablation et d’imagerie. Ajustez le microscope pour qu’il fasse la mise au point sur le plan de l’épithélium de l’aile de nymphe le plus proche de la lamelle de verre (c’est-à-dire sur la région de l’épithélium à blesser) à l’aide du bouton de commande de mise au point fine.
4. À l’aide des réglages de la platine du microscope, positionnez l’aile de la nymphe de manière à ce que la zone à blesser soit directement alignée avec la zone cible connue du laser d’ablation.
5. Utilisez une lame d’atténuateur de densité d’énergie installée sur le microscope pour régler manuellement le niveau de puissance de la lampe d’ablation.
   note: Le curseur de l’atténuateur dispose d’arrêts de clic et de lignes pour identifier le niveau relatif d’atténuation et permettre l’utilisation de paramètres reproductibles.
6. À l’aide d’une commande manuelle externe, activez le laser d’ablation à l’aide d’un simple clic bref sur la gâchette pour faire une plaie. Vérifiez l’apparition de la bulle d’air transitoire au site d’ablation, car les blessures seront normalement accompagnées de celle-ci. Vérifiez si la blessure induite par le laser a réussi à l’aide des filtres fluorescents appropriés pour visualiser l’épithélium de la nymphe.
   note: Veillez à ne pas vous exposer accidentellement aux faisceaux laser, car les réflexions du faisceau peuvent causer de graves lésions oculaires ou cutanées.
7. Si la blessure échoue, variez le plan focal (en déplaçant la mise au point du microscope légèrement au-dessus ou en dessous du niveau focal actuel) et répétez l’opération en cliquant sur la gâchette d’ablation. Vous pouvez également augmenter progressivement la puissance du laser à l’aide de la glissière de l’atténuateur jusqu’à ce que la taille de plaie souhaitée soit atteinte.
8. Pour faire varier le taux de répétition des impulsions du laser d’ablation, utilisez le bouton de taux de répétition sur le panneau de commande arrière (qui modifie le taux de moins de 1 impulsion/s jusqu’à 60 Hz). Pour une blessure optimale, réglez le taux de répétition du pouls sur 40 Hz.
9. Pour générer des plaies de différentes tailles, utilisez la glissière de l’atténuateur de densité d’énergie pour régler manuellement le niveau de puissance de la lumière d’ablation.
10. Évitez de blesser toutes les pupes montées et utilisez ces pupes non ablatées comme témoins non blessés.
11. Pour des résultats cohérents, réalignez régulièrement le système d’ablation (à l’aide du manuel d’utilisation correspondant). Nettoyez et remplissez également la cellule de résonateur à colorant qui contrôle la longueur d’onde de sortie du laser.

4. Imagerie confocale time-lapse in vivo

1. Transférez rapidement la parabole à fond de verre vers un microscope approprié pour l’imagerie en accéléré.
   note: Pour des résultats optimaux, utilisez un microscope confocal ou à disque rotatif de haute spécification équipé de détecteurs sensibles capables de détecter à la fois les fluorophores de protéine fluorescente verte (GFP) et de mCherry.
2. Pour imager l’ensemble de l’aile nymphale, utilisez une lentille d’objectif à faible grossissement (p. ex. 20X) (figure 2A). Pour imager la réparation de la plaie et la réponse inflammatoire qui l’accompagne avec une haute résolution spatiale, utilisez les objectifs à immersion dans l’huile 40X (NA 1,3) ou 63X (NA 1,4) (voir les images représentatives de la figure 2B-D).
3. Ouvrez le logiciel de capture d’images approprié associé au microscope.
4. À l’aide du logiciel de capture d’image, allumez les lasers appropriés, par exemple les lasers 488 nm et 561 nm, pour visualiser respectivement les fluorophores GFP et mCherry (en cliquant dans les cases correspondantes) et ajustez la puissance laser et les paramètres de gain/décalage pour donner un signal fluorescent suffisant tout en évitant la saturation des pixels ; utilisez la puissance laser la plus faible possible (dans la plage de 5 à 20 %) pour minimiser le photoblanchiment et la phototoxicité.
5. Pour capturer à la fois l’épithélium réparateur et le recrutement des cellules inflammatoires, réglez le microscope pour enregistrer une pile z à l’aide des boutons de réglage de la mise au point fine sur le panneau de commande ; pour des résultats optimaux, réglez le logiciel (à l’aide de clics manuels) pour enregistrer des tranches z à travers l’aile de la nymphe (au moins tous les 3 mm), du haut de l’épithélium blessé jusqu’à l’espace extracellulaire situé en dessous (contenant les hémocytes migrateurs) pour obtenir une grande pile z (dans la gamme de 50 à 100 mm).
6. Pour l’imagerie en accéléré, enregistrez les piles z à intervalles réguliers (au moins toutes les 30 s) pendant au moins 1 h après la blessure.
   note: L’intervalle de temps exact entre les empilements z choisis représente un compromis entre la capture de la dynamique cellulaire en évolution rapide et l’évitement du photo-blanchiment des échantillons.
7. Pour imager simultanément plusieurs pupes (y compris les témoins non ablatés non blessés), utilisez une platine motorisée (fixée au microscope) et la fonction d’acquisition multi-positions disponible dans le logiciel d’imagerie. Réglez manuellement la position de chaque nymphe dans le logiciel à l’aide des boutons de commande de position de la scène, puis réglez manuellement les limites z-stack appropriées (haut et bas) pour chaque nymphe.
8. Visualisez les images en accéléré pendant la capture d’image ou plus tard avec un logiciel d’analyse d’image spécialisé (tel que ImageJ) en utilisant des projections z-stack ou un rendu 3D. Par exemple, pour suivre les mouvements d'hémocytes individuels (comme dans les figures 2C' et D'), suivez les noyaux d'hémocytes à l'aide des plug-ins ImageJ en libre accès « TrackMate » ou « Manual Tracking » (méthodes publiées en).
9. Utilisez des sondes photoconvertibles (telles que Kaede) pour photoconvertir et marquer sélectivement un sous-ensemble de cellules épithéliales ou immunitaires pendant l’imagerie.
   1. Ouvrez les modules appropriés dans le logiciel d’imagerie pour effectuer la photoconversion (tels que le module de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et le module de récupération de fluorescence après photo-blanchiment) et activez le laser 405 nm (en cliquant dans la boîte du logiciel correspondant).
   2. Sélectionnez les cellules à photoconvertir dans le logiciel FRAP à l’aide de l’outil de sélection carré, circulaire ou à main levée. Dans le logiciel FRAP, réglez le temps de photoconversion (blanchiment) sur une seule itération/image et réglez le laser 405 nm à 20 % de puissance laser. Cliquez manuellement sur Démarrer l’expérience pour effectuer la photoconversion.
   3. Quittez le module FRAP (cliquez sur Fermer) et revenez à l’écran d’imagerie d’origine dans le logiciel ; utilisez les lasers 488 nm et 561 nm pour imager le comportement des cellules photoconverties et non photoconverties en configurant un enregistrement z-stack et time-lapse comme ci-dessus.
      note: Les sondes photoconverties restent stables pendant de nombreuses heures après la photoconversion initiale, ce qui permet de suivre le comportement des cellules photoconverties dans le temps (pendant au moins 5 h). Par exemple, les cellules inflammatoires de la plaie peuvent être photoconverties de manière sélective (Figure 2F) et leur comportement peut être suivi au fur et à mesure de leur résolution à partir du site de la blessure (Figure 2G et H).

Results

Figure 1 : Préparation de la nymphe de la drosophile pour la blessure et l’imagerie en direct. (A) Prénymphes blanches de la drosophile collectées à 0 h APF, l’extrémité antérieure étant indiquée par des appendices respiratoires éversés (spiracles). (B) Après avoir élevé des prénymphes APF blanches 0h pendant 18 h à 25 °C, le puparium apparaî...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Souches de drosophiles
E-cadhérine omniprésente marquée GFP ; Ubi-p63F-shg.GFP ; (chrII)	Centre d’approvisionnement de Kyoto, DGRC	#109007	Les séquences promotrices d’Ubi-p63E pilotent l’expression de la drosophile E-cadhérine (fusil de chasse) marquée à l’extrémité C-terminale avec GFP.
E-cadhérine omniprésente marquée GFP ;; Ubi-p63F-shg.GFP (III)	Centre de stock de drosophile de Bloomington (Université de l’Indiana)	Réf. 58742	Les séquences promotrices d’Ubi-p63E pilotent l’expression de la drosophile E-cadhérine (fusil de chasse) marquée à l’extrémité C-terminale avec GFP.
Moesin P{sGMCA}3.1	Centre de stock de drosophile de Bloomington (Université de l’Indiana)	Réf. 59023	Le promoteur/amplificateur de sqh, exprimé de manière ubiquitaire, entraîne l’expression d’un fragment de Moesin (qui comprend les séquences de liaison à l’actine) marqué avec GFPS65T.
Pilote serpent-Gal4 spécifique aux hémocytes ; srp-Gal4 ;	Généré par Katja Bruckner	Généré par Katja Bruckner	L’expression de Scer\GAL4 fusionné à une queue polyA est contrôlée par 2 séquences génomiques en amont du serpent Drosophila. Réf. : Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. Le récepteur PDGF/VEGF contrôle la survie des cellules sanguines chez la drosophile. Cellule de développement. 7 (1), 73–84, doi : 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nucléaireRFP w1118 ;; P{UAS-RedStinger}6	Centre de stock de drosophile de Bloomington (Université de l’Indiana)	#8545 ou #8547	Les séquences réglementaires UAS pilotent l’expression de la forme DsRed.T4 de RFP qui est marquée à l’extrémité C-terminale avec un signal de localisation nucléaire
UAS-cytoplasmiqueGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}	Centre de stock de drosophile de Bloomington (Université de l’Indiana)	Plusieurs stocks disponibles (par exemple #1522)	Expression de la version S65T de la GFP par les séquences régulatrices de l’UAS ; la variante S65T présente une luminosité accrue.
UAS-photoconvertibleKaede w1118 ;; P{UAS-Kaede.A}3	Centre de stock de drosophile de Bloomington (Université de l’Indiana)	Réf. 26161	La protéine Kaede émet une fluorescence vert vif après la synthèse, mais se transforme efficacement en une fluorescence rouge vif et stable lors de l’irradiation par UV.
Courge spaghetti marquée GFP w1118 ;; P{sqh-GFP.RLC}	Centre de stock de drosophile de Bloomington (Université de l’Indiana)	Réf. 57145	La région codante sqh, qui est balisée à l’extrémité C-terminale avec une balise T :Avic\GFPS65T, est exprimée sous le contrôle du promoteur naturel sqh.
Ingrédients pour les supports alimentaires contre les mouches			Les milieux alimentaires contre les mouches sont fabriqués selon des procédures standard (voir Greenspan, R. 1997. Poussée de mouches : la théorie et la pratique de la génétique de la drosophile. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pages.)
maïs	Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)	Contacter directement le fournisseur	organique
Farine de soja	Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)	Contacter directement le fournisseur	organique
Extrait de malt	Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)	Contacter directement le fournisseur	organique
mélasse	Wild Oats, Bristol, Royaume-Uni (ou fournisseur équivalent)	Contacter directement le fournisseur	organique
Gélose Difco	BD Biosciences, Fisher Scientific	Référence : DF0142-15-2	Pour la préparation de nourriture pour mouches
Acide propionique	sigma	402907	Pour la préparation de nourriture pour mouches
Nipagen	sigma	Référence 79721	Pour la préparation de nourriture pour mouches
Levure de boulanger séchée	Redstar, Dutscher Scientific, Royaume-Uni Ltd	Redstar, Dutscher Scientific, Royaume-Uni Ltd	Pour la préparation de nourriture pour mouches
Préparation et montage des échantillons
Parafilm	sigma	P7793-1EA	Pour la préparation de la colle heptane
Pinceau zibeline	Daler-Rowney (ou équivalent)	#0 ou 1
forceps	Fisher Scientific (ou Fine Science Tools)	NC9404145	Dumont #5
Boîtes à fond en verre pour l’imagerie	MatTek	P35G-0-10-C	Nous vous suggérons d’utiliser des boîtes de Pétri de 35 mm, avec un Microwell d’au moins 10 mm, un verre de couverture de 0,085 à 0,13 mm, non revêtu. Des boîtes avec des micropuits plus grands permettront de monter et d’imager un nombre croissant de pupes en une seule expérience.
heptane	sigma	51730-5ML	Pour la préparation de la colle heptane
Ruban adhésif double face (par exemple Scotch)	Agar Scientific	AGG263	Pour la préparation de la colle heptane
Tube de 50ml (pour colle heptane)	Tubes Falcon de Fisher Scientific	Tél. : 14-432-22	Pour la préparation de la colle heptane
Lames de microscope en verre	Agar Scientific	AGL4244	Pour la dissection des pupes de drosophile
Stéréomicroscope de dissection à fond clair	Leica (ou équivalent)	M50	Pour la dissection des pupes de drosophile
Microciseaux	John Weiss International	103123	Ciseaux de recherche miniatures (droits)
Ablation laser et imagerie
Laser d’ablation Nitogen	Spectra-Physique (ou équivalent Andor)	Modèle VSL-337ND-S	Pour les blessures, il doit être attaché à un système d’imagerie à grand champ
Microscope confocal à balayage laser multilaser (CLSM)	Leica (ou équivalent)	TCS AOBS SP8 ou SP5-II fixé à un microscope à épifluorescence inversée Leica DMi8 (ou équivalent)	Idéalement, il comprend une platine motorisée pour le balayage multi-sites et « mosaïque », ainsi que des détecteurs GaAsP « hybrides » (qui offrent une sensibilité beaucoup plus grande et une amplification du signal faible)
Chambre environnementale	Services d’imagerie de vie (ou équivalent)	« Système de contrôle de la température du microscope »	Fixé au microscope confocal pour le contrôle de la température pendant l’imagerie
Logiciel d’analyse d’images
Module logiciel FRAP	Leica (ou équivalent)	Module logiciel CLSM FRAP	Pour la photoconversion de fluorophores photoconvertibles tels que Kaede
ImageJ (logiciel d’analyse d’images)	Instituts nationaux de la santé (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. « NIH Image to ImageJ : 25 ans d’analyse d’images ». Nature Methods 9, 671-675, 2012.
Plugin ImageJ « Suivi manuel »	Instituts nationaux de la santé (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
Plugin ImageJ « TrackMate »	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY. ; Perry, N. et Schindelin, J. et al. (2016), « TrackMate : Une plateforme ouverte et extensible pour le suivi d’une seule particule », Méthodes 115 : 80-90, PMID 27713081
Volocity (logiciel d’imagerie 3D haute performance)	Perkin Elmer	Volocité 6,3	Pour l’analyse d’images
IMARIS (logiciel d’analyse d’images)	Plan binaire	IMARIS pour les biologistes cellulaires	Pour l’analyse d’images