Dosage de l’opsono-adhérence pour évaluer l’opsonisation de bactéries encapsulées par des anticorps anti-capsule

Résumé

Source : Chua, J., et al. Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Anticorps in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente un test d’opsono-adhérence pour examiner l’interaction entre les bactéries opsonisées et les cellules immunitaires. Des bactéries marquées par fluorescence, traitées avec un sérum de test contenant des anticorps anti-capsule, sont incubées avec des macrophages. Après avoir coloré les macrophages avec la fluorescence, les bactéries attachées à la surface des macrophages sont observées au microscope pour la visualisation.

Protocole

1. Culture et préparations bactériennes

NOTE : L’espèce bactérienne utilisée dans ce protocole est une souche virulente encapsulée, B. anthracis Ames. Toutes les manipulations avec cette espèce nécessitent des autorisations de biosécurité et de biosécurité appropriées et doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II ou III située dans un laboratoire BSL-3. Suivre les procédures opérationnelles de l’établissement pour le travail BSL-3 et pour l’utilisation de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation de bactéries.

1. Préparez le bouillon d’infusion Cerveau-Cœur (BHI) en dissolvant 37 g de poudre de BHI dans 1 L d’eau et en l’autocavant à 121 °C pendant 15 min. Conservez le bouillon à température ambiante.
2. Préparez une solution de bicarbonate de sodium à 8 % dans de l’eau et stérilisez à l’aide d’une seringue filtrante de 0,20 μm. Conserver la solution à 4 °C et l’utiliser dans la journée.
3. Mélangez 8 g de bouillon nutritif, 3 g d’extrait de levure et 15 g de gélose dans 1 L d’eau pour préparer des plaques de gélose NBY. Autoclave à 121 °C pendant 15 min. Verser dans des boîtes de Pétri et laisser solidifier. Stocker les plaques à 4 °C
   note: Les plaques de gélose NBY peuvent être fabriquées avec ou sans bicarbonate de sodium. L’ajout de bicarbonate de sodium dans les plaques de bouillon et de gélose induit la croissance de colonies mucoïdes constituées de bacilles encapsulés. La concentration finale de bicarbonate de sodium dans les milieux liquides et solides est de 0,8 %.
4. Préparez le bouillon de culture pour B. anthracis en mélangeant 50 % de bouillon BHI autoclave, 40 % de FBS et une solution de bicarbonate de sodium à 10 % (v/v).
   note: Ce bouillon est formulé pour produire de courtes chaînes de bacilles encapsulés.
5. Préparez une plaque maîtresse de B. anthracis en la striant pour l’isolement sur une plaque de gélose NBY à partir d’un stock de spores un jour avant de la cultiver dans le bouillon. Incuber à 37 °C.
6. Inculquer 30 mL de bouillon de culture dans une fiole ventilée de 250 mL contenant plusieurs colonies de B. anthracis.
   note: Un rapport volume/surface spécifique de bouillon, tel que spécifié ici, est nécessaire pour produire des bacilles encapsulés au maximum.
7. Agiter la culture en bouillon à 125 tr/min, 37 °C avec 20 % de CO₂ et de l’humidité pendant 18 à 24 h
   note: La croissance de B. anthracis à des températures supérieures à 37 °C peut inhiber la production de capsules.
8. Utilisez une coloration négative à l’encre de Chine pour assurer une encapsulation suffisante et que les bacilles sont en chaînes courtes (1 à 5 bacilles/chaîne) avant la fixation (voir rubrique 2).
9. Pour déterminer les unités formant colonies (UFC), diluer en série 100 μL de culture 1:10 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et diluer les dilutions de culture sur des plaques de gélose au sang de mouton. Incuber pendant 12 à 18 h à 37 °C. Compter les UFC et déterminer le nombre de bactéries par mL de culture.
   note: Le comptage peut également être effectué à l’aide d’un hémocytomètre sous le microscope une fois que les bactéries ont été fixées. Cependant, cela n’est pas recommandé car les bacilles sont difficiles à voir à faible grossissement.
10. Ajouter 16 % de paraformaldéhyde (PF) à l’ensemble du volume de culture bactérienne à une concentration finale de 4 % de PF pour fixer les bacilles. Agiter lentement sur un agitateur à température ambiante pendant 7 jours.
    note: Sept jours d’incubation dans un PF de 4 % est basé sur la procédure opérationnelle standard institutionnelle de l’Institut de recherche médicale sur les maladies infectieuses de l’armée des États-Unis (USAMRIID) pour la fixation des bacilles végétatifs.
11. Pour retirer le fixateur et tester la stérilité, laver trois fois 4 mL (10 % du volume) de suspension bactérienne fixe dans un tube conique de 50 mL par centrifugation à ≥3000 x g pendant 45 min et en utilisant un lavage de 30 mL/PBS. Stocker l’échantillon restant dans un PF à 4 % à 4 °C
    note: Après la granulation, la pastille bactérienne est moelleuse en raison de la présence d’une capsule. Veillez à ne pas déranger la pastille pendant le lavage. Il est nécessaire de retirer tout fixateur afin qu’il n’interfère pas avec le test de viabilité. Si nécessaire, augmentez le nombre de lavages.
12. Pour les essais de viabilité, inoculer 40 mL d’un milieu de croissance bactérienne (p. ex. bouillon BHI) avec 4 mL de suspension lavée (≤ 10 % du volume du bouillon) et incuber à 37 °C pendant 7 jours. Vérifiez la densité optique à 600 nm avant et après 7 jours pour mesurer la turbidité.
13. Après 7 jours d’incubation en culture de bouillon, déposer ≥100 μL de bouillon sur une plaque de gélose et incuber pendant 7 jours supplémentaires. Si aucune augmentation de la turbidité et aucune croissance sur les plaques n’est observée, la culture originale est considérée comme stérile et peut être transférée à un laboratoire BSL-2.
    REMARQUE : Le programme fédéral d’agents sélects exige que B. anthracis inactivé ne puisse être transféré à partir de laboratoires BSL-3 qu’après avoir démontré la stérilité complète de l’échantillon. L’essai de viabilité de B. anthracis inactivé consiste à cultiver 10 % de l’échantillon dans un bouillon pendant 7 jours, puis à le cultiver sur un milieu solide pendant 7 jours supplémentaires. Suivez les directives de l’établissement pour recevoir l’approbation du transfert une fois la stérilité établie.         

2. Coloration négative et microscopie optique pour observer l’encapsulation et les chaînes de bacilles

1. Mélangez 5 μL de suspension bactérienne avec 2 μL d’encre de Chine sur une lame de microscope. Placez un verre de protection de 1 ou 1,5 μm d’épaisseur sur le dessus de la suspension sans créer de bulles.
   note: Du vernis à ongles peut être utilisé pour sceller le verre de protection sur la lame.
2. Observez la suspension bactérienne à l’aide d’une lentille d’objectif à huile 40x à 100x sur un microscope optique. Assurez-vous que les bacilles sont encapsulés en observant une zone de clairance (la capsule exclut l’encre de Chine) entourant chaque bactérie et que les chaînes des bacilles sont courtes.

3. Marquage FITC des bactéries

1. Dissoudre l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans le sulfoxyde de diméthyle à une concentration de 2 mg/mL.
2. Mesurez le volume de stock bactérien inactivé.
3. Lavez le bouillon 3 fois dans du PBS pour enlever le fixateur.
4. Ajouter la solution de FITC à une concentration finale de 75 μg/mL. Agitez lentement le mélange pendant 18 à 24 h à 4 °C.
5. Lavez trois fois les bactéries en les granulant à ≥ 3000 x g, 45 min, et en utilisant 30 ml de PBS/lavage pour éliminer l’excès de FITC. Assurez-vous que la pastille moelleuse n’est pas dérangée pendant le lavage. Remettez les bacilles en suspension dans PBS au même volume de départ.
6. Aliquote et conservez les bacilles dans des microtubes à -20 °C jusqu’à utilisation. Ne congelez pas/décongelez les bacilles plusieurs fois car les bacilles pourraient perdre leur capsule.

4. Opsonisation bactérienne

1. La chaleur inactive un petit volume de sérums d’essai (provenant de primates non humains, PNH) à 56 °C pendant 30 minutes dans un bloc thermique.
2. Décongeler et laver les bactéries marquées au FITC avec du PBS 2x en granulant à 15000 x g pendant 3 à 5 min. Remettre en suspension dans le PBS au même volume de départ.
3. Dans une plaque à fond rond de 96 puits (plaque #2), diluez en série les sérums d’essai dans un milieu cellulaire. Dans une autre plaque à fond rond de 96 puits (plaque #3), ajoutez 10 μL de sérum d’essai dilué dans chaque puits.
   note: Dans chaque plaque, du PBS et des sérums normaux de singe ont été inclus à la place des sérums dilués en tant que témoins négatifs. Nous avons également choisi un sérum de test comme contrôle positif pour générer une courbe standard afin de normaliser tous les tests effectués à des jours différents. Le sérum de test de contrôle positif a été choisi arbitrairement parce qu’il était abondant.
4. Dans l’assiette #3, ajouter 10 μL de complément de bébé lapin fraîchement reconstitué.
   note: Une fois reconstitué, jeter le reste du complément de bébé lapin ; Ne pas recongeler et décongeler.
5. À la plaque #3, ajoutez le volume approprié de bacilles marqués FITC pour une multiplicité d’infection de 1:20. Par exemple, ajoutez le volume qui contient 5 x 10⁴ x 20 bacilles pour 5 x 10⁴ cellules. Complétez chaque puits de la plaque #3 avec le volume approprié de milieu cellulaire pour un total de 105 μL.
   note: La plaque #1, qui contient des cellules, reçoit 100 μL de bactéries opsonisées avec les 5 μL restants comme volume de vide. Nous avons testé chaque dilution du sérum de test en double.
6. Incuber la plaque #3 à 37 °C pendant 30 min en présence de 5 % de CO₂ avec de l’humidité pour opsoniser les bacilles.

5.Dosage de l’adhérence et marquage fluorescent des cellules de mammifères

1. Maintenez tous les réactifs à 37 °C avant utilisation.
2. Placez la plaque #1, qui contient des cellules adhérentes, sur un bloc de chaleur à 37 °C.
3. À l’aide d’une pipette multicanaux, retirez le milieu usé des puits et remplacez-le rapidement par 100 μL de bactéries opsonisées de la plaque #3. Assurez-vous qu’aucune bulle n’a été générée dans les puits pendant le pipetage. Incuber la plaque #1 à 37 °C avec 5 % de CO₂ et de l’humidité pendant 30 min pour l’adhérence.
4. Lavez chaque puits 5 fois avec 150 μL de PBS sur un bloc de chaleur à 37 °C pour éliminer les bacilles non attachés><. note: Il faut veiller à ce que les cellules ne soient pas dispersées accidentellement pendant le lavage.
5. Diluer 16 % de PF avec du PBS 1:4 pour obtenir 4 % de PF. Fixer les cellules avec 4 % de PF pendant 1 h en ajoutant 150 μL dans chaque puits. Laver les cellules 2 fois avec du PBS.
6. Mélangez 2 μL de coloration Orange Cell HCS (criblage à haut contenu) dans 10 mL de PBS. Ajouter 150 μL de cette solution de coloration dans les cellules fixées et incuber pendant 30 min à température ambiante.
7. Lavez les puits 2x avec PBS.
8. Conserver à 4 °C jusqu’au microscope.

6. Microscopie

REMARQUE : En général, un microscope à fluorescence automatisé à haut débit facilitera l’imagerie pour l’OAA. Si un système automatisé n’est pas disponible, des images fluorescentes des bacilles adhérents peuvent être prises manuellement. Dans cette étude, les bacilles adhérents et les monocouches cellulaires ont été imagés à l’aide du système de microscopie à balayage laser Zeiss 700 avec un équipement spécialisé ; notre système était composé du microscope inversé Zeiss Axio Observer Z1 équipé d’une platine automatisée, du module Definite Focus, d’un objectif 40 x NA 0.6, d’une caméra Axio Cam HRc et du logiciel Zen 2012 (Blue Edition). Les images acquises sont des images à grand champ et non des images confocales. Le protocole suivant est conçu comme une configuration de microscope de base qui s’applique à une variété de systèmes de microscopie automatisés.

1. Incuber la plaque #1 à température ambiante pendant 30 min. Allumez le microscope et l’équipement associé.
   note: L’acclimatation à température ambiante empêche la formation de condensation sur la plaque de verre pendant l’imagerie. De plus, il empêche la défocalisation due aux changements de température.
2. Placez la plaque sur la platine et concentrez-vous sur les cellules en utilisant un champ clair ou un contraste de phase.
3. Sélectionnez le format 96 puits comme réglage de la plaque. Sélectionnez les paramètres de la chaîne.
   note: Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission maximales du FITC sont de 495/519 nm ; les colorations des cellules orange HCS sont de 556 et 572 nm. D’autres fluorophores peuvent être utilisés en fonction des filtres disponibles sur le microscope.
4. Sélectionnez le paramètre sur le mode Mosaïque. Indiquez le nombre d’images à acquérir.
   note: La fonction de mosaïque permet de capturer plusieurs emplacements dans un puits d’échantillon et peut être configurée pour acquérir une image dans un format de mosaïque ou aléatoire. Nous avons imagé 10 zones aléatoires par puits.
5. Changez le mode d’acquisition en « noir et blanc » ou « monochrome » et le binning ≥ 2x2.
   note: Le réglage du binning de 1x1 à 2x2 ou 4x4 augmenterait la vitesse de microscopie, mais entraînerait également une résolution plus faible de l’image. Pour l’OAA, il suffit d’utiliser ces paramètres car le test énumère à la fois les macrophages et les bactéries adhérentes.
6. Activez l’autofocus ou le module de mise au point. Indiquez la fréquence à laquelle la fonction de mise au point automatique doit être effectuée. Activez la fonction Z stack, le cas échéant. Indiquez le nombre d’empilements Z qui captureront l’épaisseur de la monocouche cellulaire et des bacilles adhérents.
   note: Le nombre de piles Z choisi augmentera le temps de microscopie, mais garantira qu’une image avec la bonne mise au point est prise à chaque pile Z.
7. Désignez un dossier de fichiers dans lequel enregistrer les images. Exécutez le programme d’imagerie automatisé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre à seringue de 0,20 μm (25 mm, cellulose régénérée)	Corning, État de New York	431222
Seringue de 10 mL (embout Luer-Lock)	BD, Franklin Lakes, NJ	302995
Plaques noires 15μ 96 puits (plaque #1 pour l’imagerie)	In Vitro Scientific, Sunnyvale, Californie	P96-1-N
16 % de paraformaldéhyde	Microscopie électronique, Hatfield, Pennsylvanie	Référence 15710
Fiole traitée pour culture tissulaire de 75 cm carrés	Corning, État de New York	430641
Agar (poudre)	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	N° A1296
Complément Bébé Lapin	Cedarlane Labs, Burlington, Caroline du Nord	Référence : CL3441
Extrait de levure Bacto	BD, Sparks, MD	Référence 288620
Perfusion cerveau-cœur BBL (BHI)	BD, Sparks, MD	211059
Plaques d’agar-sang (TSA avec sang de mouton)	Remel, Lenexa, KS	Réf. R01198
Racleur de cellules	Sarstedt, Newton, Caroline du Nord	83.183
Plaques de culture cellulaire Costar 96 puits (plaques #2 et 3 pour les dilutions)	Corning, État de New York	Référence 3596
Verre de protection	Microscopie électronique, Hatfield, Pennsylvanie	Référence 72200-10
Bouillon nutritif Difco	BD, Sparks, MD	Référence 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), teneur élevée en glucose	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Référence 11965-092	Contient 4500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamine, rouge de phénol
Système d’imagerie cellulaire automatique EVOS FL (microscope à fluorescence)	Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
Sérum fœtal bovin	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT	SH30071.03	Non irradié aux rayons gamma, non inactivé à la chaleur
Isothiocyanate de fluorescéine	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	F143
HCS Cell Mask Coloration Orange Cell	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	N° H32713
hémocytomètre (Neubauer amélioré)	Hausser Scientific, Horsham, Pennsylvanie	Référence 3900
La solution India Ink	BD, Sparks, MD	261194
L-glutamine (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA	25030081	Milieu de supplémentation avec 2 mM de L-glutamine supplémentaires
Nikon Eclipse TE2000-U (microscope composé inversé)	Nikon Instruments, Melville, NY	TE2000
PBS sans calcium ni magnésium	Lonza, Walkersville, Maryland	17-516F
Solution de pénicilline-streptomycine, 100x	Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT	SV30010
Boîtes de Pétri (100 x 15 mm)	Falcon, Corning, Durham, Caroline du Nord	351029	Pour plaques de gélose
Lignée cellulaire de macrophage RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, Manassas, Virginie	ATCC TIB-71
Diapositives	VWR, Radnor, Pennsylvanie	Référence 16004-422
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	S5761
Trypan Blue Solution (0,4 %)	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Réf. T8154
Microscopie à balayage laser Zeiss 700 (microscope confocal)	Carl Zeiss Micro-imagerie, Thornwood, NY	4.109E+15