Évaluation de l’activation contrôlée des lymphocytes T avec un CMH peptidique photoactivable

Résumé

Source : Sanchez, E., et al. Contrôle spatial et temporel de l’activation des lymphocytes T à l’aide d’un agoniste photoactivable. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Cette vidéo présente une méthode de décageage d’un complexe photoactivable d’histocompatibilité peptide-majeur à l’aide de l’irradiation UV. Le processus de décaging expose la séquence peptidique native, permettant une activation précise des lymphocytes T.

Protocole

1. Préparation des surfaces vitrées stimulatrices

1. Enduire le verre de couverture à huit chambres avec de la poly-L-lysine biotinylée (Bio-PLL) diluée à 1:500 dans de l’eau distillée désionisée (ddH₂O). Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (RT).
2. Laver avec H₂O.
3. Sécher pendant 2 h à RT.
4. Bloquer les surfaces revêtues de Bio-PLL avec un tampon de blocage (solution saline tamponnée HEPES [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], avec 2 % de BSA) pendant 30 min à RT.
   1. Dissoudre 5 mg de bromhydrate de poly-L-lysine dans 1 mL de 10 mM de NaPO4, pH 8,5.
   2. Ajoutez 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotine (à partir d’un stock de 100 mg/mL dans du DMSO) et vérifiez le pH de la réaction. Si le pH est inférieur à 8,5, ajoutez 2 μL de NaOH 4 N pour l’augmenter entre 8,5 et 9,5.
   3. Vortex pendant 30 min.
   4. Tremper la réaction avec 50 μL de glycine 100 mM dissoute dans 20 mM de Tris pH 8,0.
   5. Tournez à pleine puissance pendant 10 min et transférez le surnageant dans un nouveau tube.
      REMARQUE : La qualité de la Bio-PLL est généralement comparée à celle des préparations précédentes en enrobant des dilutions en série deux du matériau sur une plaque ELISA à 96 puits et en quantifiant la teneur en biotine après incubation avec de la streptavidine couplée à la phosphatase alcaline.
5. Retirez la mémoire tampon de blocage. Ne laissez pas les puits sécher. Ajouter la streptavidine (100 μg/mL dans un tampon de blocage). Incuber pendant 1 h à 4 °C.
6. Laver au HBS. Remplissez et retournez les puits de la chambre 4 à 5 fois, en retirant le HBS des puits. Ne laissez pas les puits sécher.
7. Ajoutez les ligands biotinylés du pMHC et les molécules d’adhésion à la surface.
   note: Le MCC et l’OVA peuvent être photocages en ajoutant des groupes protecteurs à base d’ortho-nitrobenzyle (par exemple, nitrophényléthyl (NPE) ou nitrovératryloxycarbonyle (NVOC)) au groupe ε-amino des lysines clés (K12 dans le MCC, K7 dans l’OVA). Le MCC et l’OVA photocaged peuvent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux. Après reconstitution dans un tampon aqueux, ils sont repliés en I-E^k et H2-K^b exprimés par des bactéries en utilisant des approches établies.
8. Validation du peptide MCC ou OVA photoactivable
   1. Decage des peptides protégés NVOC par irradiation UV avec une lampe UV portative (voir tableau des matériaux) pendant 20 min à RT.
   2. Pulsez 1,0 x 10⁵ APC avec 1 μM de peptide non stimulateur (témoin négatif, par exemple Hb), de peptide photoactivable non irradié, de peptide photoactivable irradié et de peptide agoniste (témoin positif, par exemple MCC) pendant 1 h à toute une nuit à 37 °C.
   3. Pour stimuler les lymphocytes T exprimant la 5C. C7/2B4/ET TCR, utilisez des cellules B CH12 ou CH27. Pour stimuler les lymphocytes T OT1, utilisez les cellules de thymome RMA-s ou EL4.
   4. Mélanger les APC pulsés avec un nombre égal de cellules T dans des plaques à fond rond à 96 puits à un volume final de 200 μL. Incuber à 37 °C pendant 12 à 24 h.
   5. Récupérez les surnageants de chaque puits et analysez l’IL-2 par ELISA avec détection colorimétrique streptavidine-peroxydase de raifort.
      REMARQUE : Il est fortement recommandé de confirmer l’état de cage de tous les peptides par spectrométrie de masse par électronébulisation avant de les replier dans les complexes CMH.
9. Effectuez le pliage et la purification du CMH de manière à minimiser l’exposition à la lumière. Par exemple, enveloppez les réactions de pliage dans une feuille d’aluminium et effectuez une chromatographie de filtration sur gel avec la lampe UV éteinte.
   note: Il a été constaté que les MCC-I-E^k et OVA-H2-K^b photoactivables induisent l’activation des lymphocytes T indépendants des UV à haute densité, peut-être en raison d’une cage fonctionnelle incomplète. Par conséquent, le pMHC photoactivable est dilué dans un excès de 10 à 30x de pMHC non stimulateur (par exemple I-E^k contenant le peptide de l’hémoglobine (Hb)) pendant l’étape d’immobilisation. Cela améliore le rapport signal/bruit de l’expérience d’imagerie ultérieure.
10. Pour photoactiver les lymphocytes T CD4⁺, utilisez collectivement un mélange de Hb-I-Ek biotinylé (3 μg/mL), de MCC-I-E^k photoactivable biotinylé (0,1 μg/mL) et d’anticorps biotinylés contre le CMH H2-K^k de classe I (0,5 μg/mL). L’anticorps anti-H2-K^k encourage le 5C. Les cellules T C7/2B4/AND, qui expriment H2-K^k, se propagent sur la surface du verre sans subir d’activation.
11. Pour les lymphocytes T CD8⁺, utilisez un mélange de H2-Db biotinylé portant le peptide KAVYDFATL (1 μg/mL), d’OVA-H2-Kb photoactivable biotinylé (0,1 μg/mL) et du domaine extracellulaire de la molécule d’adhésion ICAM-1 (2 μg/mL produit par culture de cellules d’insectes). L’ICAM-1 encourage la formation d’un contact étroit en engageant l’intégrine LFA1 à la surface des lymphocytes T.
12. Appliquer tous les mélanges de protéines dans un tampon bloquant, suivi d’une incubation de 1 h à une RT ou d’au moins 2 h à 4 °C
    note: La densité moléculaire sur des surfaces de ce type, qui est de ~8000 par μm2, a déjà été déterminée. Étant donné que le pMHC photoactivable représente ~1/30e de la protéine biotinylée à la surface, sa densité sera de ~267 molécules par μm2, avant de décager.
13. Lavez comme à l’étape 1.6 et laissez dans HBS jusqu’au moment de l’utiliser.
14. Ajouter 200 000 lymphocytes T CD4⁺ ou CD8⁺ exprimant le TCR approprié dans chaque puits et laisser les cellules adhérer à 37 °C pendant 15 min. Une fois que les cellules se sont fixées et se sont propagées à la surface, elles sont prêtes pour la photoactivation et l’imagerie.
    note: La transduction rétrovirale des lymphocytes T effecteurs à l’aide de sondes d’imagerie fluorescente est décrite en détail ailleurs. La signalisation calcique peut également être étudiée à l’aide de lymphocytes T non transduits chargés du colorant sensible au calcium Fluo-46. Le colorant ratiométrique Fura-2 n’est pas recommandé car il nécessite une excitation dans la gamme UV, ce qui induit également une décaffination du pMHC photoactivable.

2. Acquisition d’images

1. Utilisez un microscope TIRF inversé équipé d’un objectif 150X compatible avec les UV pour l’acquisition d’images. Irradiez par rayonnement UV des régions définies par l’utilisateur à l’aide d’un système de diaphragme numérique fixé à une lampe au mercure de 100 W (HBO). Dirigez la lumière UV de cette lampe sur l’échantillon à l’aide d’un miroir passe-long de 400 nm.
2. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour la photoactivation localisée et l’acquisition en accéléré. Dans la plupart des expériences, surveillez les sondes dans les canaux vert et rouge à l’aide de lasers d’excitation de 488 nm et 561 nm, respectivement. La lumière laser est dirigée sur l’échantillon à l’aide d’un miroir dichroïque à double bande passante qui transmet également dans la gamme UV (pour permettre le décage). Veuillez consulter le tableau des matériaux et la figure 1 pour plus d’informations sur la configuration du microscope.
3. Après avoir monté la lame de chambre contenant les lymphocytes T, ajustez les paramètres pour obtenir un éclairage TIRF ou d’épifluorescence, si nécessaire. En mode direct, sélectionnez un champ de cellules qui expriment la ou les sondes fluorescentes d’intérêt. Établissez des régions à l’échelle du micron pour la photoactivation sous les cellules individuelles à l’aide d’un contrôle logiciel.
4. Lancez l’acquisition en accéléré. En règle générale, 80 points temporels sont acquis, avec un intervalle de 5 s entre chaque point temporel. Cela laisse plus que suffisamment de temps pour des expositions séquentielles de 488 nm et 563 nm, dans le cas d’expériences bicolores.
5. Après 10 points de temps, photoactivez les régions sélectionnées en ouvrant l’obturateur numérique du diaphragme pendant 1 à 1,5 s.
6. Une fois le time-lapse terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules et répétez le processus.

Résultats

Figure 1 : Configuration du microscope pour la photoactivation et l’imagerie TIRF.

Les lasers

488 nm et 561 nm sont utilisés pour l’imagerie TIRF et l’imagerie par épifluorescence des sondes vertes et rouges, respectivement. La lumière UV pour la photoactivation est prélevée à partir d’une lampe au mercure (Hg) fixée à un système de diaphragme numérique capable d’éc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Verre de protection chambré Nunc Lab-Tek	Thermofischer Scientifique	155361
Bromhydrate de poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	Référence P2636	Aura besoin de fabriquer de la poly-L-lysine biotinylée
EZ-Link NHS-Biotine	Thermofischer Scientifique	20217	Aura besoin de fabriquer de la poly-L-lysine biotinylée
Streptavidine	Thermofischer Scientifique	434301
BirA-500 : Kit de réaction standard biotine-protéine ligase BirA	avidité	BirA500	Sera utilisé pour biotinyler les protéines
Hb I-EK biotinylée			Pour le repliement des protéines, voir référence 6. Pour la biotinylation, utilisez le kit BirA
Biotinylé NPE-MCC I-EK	Anaspec		Le NPE-MCC (HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH) personnalisé peut être acheté auprès d’Anaspec
Anticorps αH2-Kk biotinylé	BD Biosciences	553591
NPE-OVA H2-Kb biotinylé	Anaspec		NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) peut être acheté auprès d’Anaspec
KAVY H2-Db biotinylé	Anaspec		Les protéines synthétisées sur mesure (KAVYDFATL) peuvent être achetées auprès d’Anaspec
ICAM1 biotinylé			Pour le repliement des protéines, voir la référence dans le protocole. Pour la biotinylation, utilisez le kit BirA
Lampe UV à main	UVP	UVGL-25	La lampe est maintenue à < 1 cm de l’échantillon. 30 s de lumière 365 suffisent pour un décageage détectable, 20 min pour un décageage quantitatif.
Système TIRF Olympus IX-81 OMAC.	Olympe		Des informations supplémentaires sur le système d’imagerie sont disponibles à la figure 6
Diaphragme numérique mosaïque	Andor
Logiciel de diaporama	Innovations en matière d’imagerie intelligente