Évaluation de la topologie immunologique des synapses par l’imagerie de cellules vivantes

Résumé

Source : Martinelli, R. et al., Un modèle de cellule planaire endothéliale pour l’imagerie de la dynamique des synapses immunologiques.J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre l’imagerie de cellules vivantes de la topologie des synapses immunologiques, en étudiant les interactions entre les lymphocytes T et les cellules épithéliales porteuses d’antigènes fluorescents. La microscopie à fluorescence révèle un déplacement du cytoplasme rouge et des anneaux membranaires jaunes dans les cellules endothéliales, indiquant la formation de synapses immunologiques.

Protocole

1. Préparation des lymphocytes T effecteurs/mémoires CD4⁺ Th1 humains

1. Appliquez un garrot sur le bras du donneur, essuyez la veine avec de l’alcool et insérez une aiguille. Prélevez lentement 15 ml de sang dans un vacutainer en utilisant l’EDTA comme anticoagulant. Lorsque le sang a été prélevé, dénouez le garrot avant de retirer l’aiguille. Appliquez immédiatement une pression sur la plaie avec de la gaze stérile lorsque l’aiguille est retirée.
2. Transférez le sang dans un tube de 50 ml. Ajouter le RPMI-1640 à RT à une dilution de 1:1 (volume final 30 ml). Superposez soigneusement le sang dilué sur deux tubes de 50 ml contenant 15 ml de milieu d’isolement lymphocytaire préfiltré tel que Ficoll-Paque à RT.
3. Centrifuger le gradient à RT pendant 30 min à 1 200 x g dans un rotor à godets oscillants. Pendant la centrifugation, préparer le milieu des lymphocytes T (500 ml de RPMI-1640, 50 ml de FCS, 5 ml de pénicilline/streptomycine).
4. Après avoir retiré le tube de 50 ml de la centrifugeuse, observez quatre couches : une pastille de globules rouges au fond, la paque, une couche de cellules qui contient des globules blancs (y compris les lymphocytes) et le plasma. Retirez délicatement la couche de globules blancs à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez-la dans un tube Falcon de 50 ml.
5. Lavez la couche de globules blancs en ajoutant le RT RPMI-1460 (jusqu’à 20 ml) et en centrifugeant à RT pendant 5 min à 1 200 x g. Remettez les globules blancs en suspension dans 1 ml de milieu de cellules T. Ajouter 5 μl de suspension cellulaire de 1 ml dans un milieu de cellules T de 250 μl dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et mélanger doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette.
6. Ajouter 25 μl de suspension cellulaire diluée à 25 μl de bleu trypan à 0,4 %. Ajouter 10 μl de mélange de chaque côté d’un hémocytomètre standard.
7. Placez l’hémocytomètre sur un microscope à lumière optique de faible puissance. À l’aide d’un objectif 10X, comptez le nombre de cellules vivantes qui ont exclu le colorant bleu Trypan et qui sont présentes dans le carré du milieu des deux côtés de l’hémocytomètre.
8. Pour calculer la concentration cellulaire, il faut multiplier la moyenne des 2 carrés par 100 (facteur de dilution) puis multiplier par 10⁴ pour obtenir le nombre de cellules/ml.
9. Ajuster la concentration finale à 0,5 x 10⁶ cellules/ml dans un milieu à cellules T. Ajouter aux cellules une concentration finale de 1 μg/ml de superantigènes bactériens, d’entérotoxine staphylococcique B (SEB) et de toxine 1 du syndrome de choc toxique (TSST). Culture pendant 72 heures (37 °C et 5 % de CO₂) pour augmenter la population de lymphocytes T CD4⁺.
10. Granulez les lymphocytes T (1 200 x g, 5 min) et mettez-les en suspension à 0,5 x 10⁶ cellules/ml dans un milieu cellulaire T avec l’ajout d’IL-15 humaine (20 ng/ml). Transférez les lymphocytes dans une fiole T150. Continuez à étendre/diviser les cellules dans le milieu complet-IL-15 toutes les 24 à 48 heures si nécessaire (en fonction de la couleur du support ; c’est-à-dire chaque fois que le média passe du rose au légèrement jaune) par la suite. Maintenir la population lymphocytaire résultante jusqu’à 15 jours.
    note: De par sa conception, ce protocole activera et étendra spécifiquement un sous-ensemble de lymphocytes T CD4⁺ qui réagissent au SEB et au TSST, puis les conduira vers un phénotype effecteur/mémoire de type Th1. D’autres globules blancs ne survivent pas et ne se développent pas dans ces conditions, de sorte qu’à l’étape 1.10, les cellules seront composées d’au moins 95 % de lymphocytes T CD4⁺, CD45RO⁺, comme on peut facilement l’évaluer par cytométrie en flux. Si vous le souhaitez, une purification supplémentaire peut facilement être réalisée à l’aide de kits de sélection positifs ou négatifs à base d’anticorps ou de billes magnétiques disponibles dans le commerce.

2. Démarrage de la culture primaire de cellules endothéliales humaines

1. Enduire une fiole T25 de fibronectine (FN) 20 μg/ml de PBS dans des conditions stériles. Laisser à RT pendant 30-60 min. Retirer FN et ajouter 5 ml de milieu complet (milieu basal endothélial (EBM-2) complété par des guillots simples EGM-2). Pré-incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant au moins 30 min.
2. Décongelez un flacon de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines ou cutanées congelées dans un bain-marie à 37 °C en agitant doucement de temps en temps pendant ~2-3 min. Transférez immédiatement les cellules dans le ballon T25 contenant le milieu préchauffé. Agitez doucement et placez dans un incubateur à 37 °C.
3. Changez le support après ~4-6 heures. Continuez à changer le support environ toutes les 48 heures (ou lorsque le support devient légèrement jaune) jusqu’à ce que la plaque atteigne ~90-95 % de confluence.

3. Division générale et expansion des cellules endothéliales

1. Cultivez les cellules à une confluence de ~90-95. Cela peut prendre de 2 à 5 jours. Pour fendre, retirez le support et rincez-le avec du PBS. Retirer le PBS et le remplacer par un volume minimum de trypsine fraîche (0,5 ml pour le T25 ou 1,5 ml pour le T75). Agitez doucement pour couvrir toutes les surfaces avec de la trypsine. Incuber à 37 °C pendant ~5 min. Surveiller le détachement des cellules de la plaque à l’aide d’un microscope optique de faible puissance.
2. Lorsque la majorité des cellules semblent arrondies ou détachées, ajoutez 5 volumes (c.-à-d. par rapport au volume de trypsine ajouté) de milieu EGM-2 complet préchauffé et pipetez doucement sur la surface du ballon pour détacher toutes les cellules.
3. Compter les cellules endothéliales à l’aide d’un hémocytomètre comme décrit en 1.6-1.7. Granuler les cellules par centrifugation (5 min, 1 200 x g). Retirez le surnageant. Ajustez la concentration à 0,5 million de cellules par ml en ajoutant un média EGM-2 MV complet préchauffé.
4. Transférez les aliquotes des cellules dans les boîtes ou les flacons appropriés revêtus de FN pour l’entretien. Agitez doucement et placez dans l’incubateur. Changez le support dans les 6 à 12 heures suivant le placage. Par la suite, le support doit être changé environ toutes les 48 heures.

4. Transfection de cellules endothéliales

REMARQUE : Les cellules endothéliales primaires sont réfractaires à la transfection par les méthodes chimiques et d’électroporation les plus courantes. La méthode basée sur la transfection nucléaire décrite ci-dessous permet une efficacité de transfection relativement élevée (~50-70 %). Une autre méthode efficace est l’utilisation de l’infection par des vecteurs viraux appropriés (voir les commentaires dans le tableau des matériaux).

1. Préparez des flacons T25 ou T75 (au besoin) de HLMVECs ou de HDMVECs jusqu’à une densité finale de 90-95 % de confluence. Enduire de fibronectine (FN) 20 μg/ml dans du PBS dans des conditions stériles, soit des plaques de culture au microscope telles que des plaques Delta-T (pour l’étape 5), soit des lamelles circulaires en verre de 12 mm placées à l’intérieur d’un puits d’une plaque de culture cellulaire à 24 puits (pour l’étape 6) comme décrit ci-dessus (2.1).
2. Ajouter 1 ml de milieu de culture EGM-2 complet dans les plaques de culture du microscope ou 0,5 ml dans chaque 24 puits et équilibrer les plaques dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO₂.
3. Prélever et compter les cellules endothéliales comme aux étapes 3.1 à 3.3. Centrifuger le volume requis de cellules (0,5 million de cellules par échantillon) à 1 200 x g pendant 5 min à RT. Remettre la pastille cellulaire en suspension avec précaution dans une solution de transfection nucléaire de 100 μl RT par échantillon.
4. Combinez 100 μl de suspension cellulaire avec 1 à 5 μg d’ADN. Transfert de la suspension de cellule/ADN dans une cuvette certifiée ; L’échantillon doit couvrir le fond de la cuvette sans bulles d’air.
   REMARQUE : Les constructions ciblant YFP ou DsRed sur la membrane cellulaire (par l’intermédiaire des 20 acides aminés N-terminaux de la neuromoduline qui contiennent un signal pour la palmitoylation post-traductionnelle) ont été utilisées seules (membrane-YFP seule ou membrane-DsRed seule) ou co-transfectées avec un marqueur volumétrique cytoplasmique (par exemple, membrane-YFP et DsRed soluble). De nombreuses permutations de marqueurs protéiques fluorescents peuvent être utilisées.
5. Fermez la cuvette avec le bouchon. Insérez la cuvette avec la suspension de cellule/ADN dans le support de cuvette de l’électroporateur et appliquez le programme d’électroporation S-005. Sortez la cuvette du support une fois le programme terminé.
6. Ajoutez ~500 μl de milieu de culture pré-équilibré dans la cuvette et retirez délicatement la suspension cellulaire de la cuvette à l’aide des pipettes de transfert en plastique fournies dans le kit de transfection nucléaire.
7. Pour les expériences utilisant un microscope, les plaques de culture séparent également la suspension cellulaire d’une réaction entre deux boîtes contenant un milieu préchauffé (étapes 4.2-4.3). Pour les expériences utilisant 24 puits/plaques, répartissez une réaction également entre 3 puits.
8. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO₂ et changer de milieu 4 à 6 heures, puis à nouveau 12 à 16 heures après la transfection.

5. Imagerie et analyse de cellules vivantes

1. Préparation de l’endothélium
   1. Jour 0 : Co-transfect HLMVECs primaires avec membrane-YFP et DsRed soluble via une technologie de nucléofection comme décrit à l’étape 4 et plaque sur des plaques de culture d’imagerie de cellules vivantes.
   2. Jour 1 : Remplacer le milieu par un milieu frais contenant de l’IFN-γ (100 ng/ml) pour induire l’expression du CMH-II. Le jour 2. Stimuler les cellules transfectées par l’ajout de 20 ng/ml de TNF-α au milieu existant.
   3. Le jour 3, incuber l’endothélium avec 1 μg/ml chacun de superantigènes bactériens, l’entérotoxine staphylococcique B (SEB) et la toxine 1 du syndrome de choc toxique (TSST) à 37 °C pendant 30 à 60 minutes immédiatement avant les expériences. Omettez cette étape pour les conditions de contrôle '-Ag'.
2. Préparation des lymphocytes
   1. Parallèlement à l’étape 5.1.3, préparer le tampon A (HBSS sans rouge de phénol) complété par 20 mM d’HEPES, pH 7,4 et 0,5 % v/v d’albumine sérique humaine préchauffée à 37 °C. Prélever un échantillon de lymphocytes en culture et déterminer la densité en comptant à l’aide d’un hémocytomètre (étapes 1.12-1.17).
   2. Centrifuger 2 millions de cellules par échantillon à 1 200 x g pendant 5 min à RT dans un tube conique de 15 ml. Aspirez le milieu et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 2 ml de tampon A de manière à ce qu’il ne reste plus d’amas de cellules.
   3. Prélever une nouvelle aliquote de colorant calcique Fura-2 et la remettre en suspension dans du DMSO pour obtenir une concentration de 1 mM.
   4. Ajouter 2 μl de solution mère de Fura-2 dans la suspension de cellules T (concentration finale de 2 μM), boucher le tube et mélanger immédiatement en inversant le tube pour assurer une dispersion uniforme du colorant. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
   5. Centrifugeuse comme à l’étape 5.2.2. Aspirez le Buffer-A et remettez doucement mais complètement en suspension les lymphocytes dans 20 à 40 μl de Buffer-A frais.
3. Configuration et acquisition de l’imagerie de cellules vivantes
   REMARQUE : Une grande variété de systèmes peut être utilisée pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes sur des microscopes à lumière verticale et à lumière inversée. Les exigences de base comprennent une source lumineuse à fluorescence et des filtres, une caméra CCD, une commutation de filtre motorisée et des obturateurs, une platine chauffée (ou une chambre chauffée montable au microscope) et un logiciel pour l’acquisition automatisée des images. Pour ce protocole, des lentilles à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique et à fort grossissement (c’est-à-dire 40X, 63X) sont nécessaires pour obtenir la résolution spatiale nécessaire. Un soin particulier doit être apporté au choix de la source de fluorescence et des lentilles appropriées pour l’imagerie calcique basée sur Fura-2, car toutes ne sont pas compatibles avec les longueurs d’onde d’excitation requises de 340/380 nm. Une autre approche (compatible avec les ensembles de filtres de fluorescence verts et rouges standard) peut être utilisée avec des colorants sensibles au calcium non ratiométriques (par exemple, Fluo-4, Rhod-3), bien que ceux-ci ne puissent pas quantifier avec précision le flux de calcium et ne fournissent qu’une lecture relative/quantitative.
   1. Allumez le système de microscope (PC pour le fonctionnement, microscope, caméra CCD, roue à filtres et lampe au xénon).
   2. Ouvrez le logiciel désigné.
   3. Configurer le microscope/logiciel pour l’imagerie accélérée multicanal automatisée. Inclure l’acquisition séquentielle d’un contraste interférentiel différentiel (DIC), d’une fluorescence verte standard, d’une fluorescence rouge standard et d’images Fura-2 à excitation standard de 340 et 380 nm. Réglez l’intervalle d’acquisition sur 10-30 sec et une durée totale de ~20-60 min.
      1. Réglez les temps d’exposition pour l’imagerie Fura-2.
         1. Ajoutez de l’huile d’objectif neuve et montez une parabole de microscope contenant seulement 0,5 ml de Buffer-A sur l’adaptateur de platine de chauffage et allumez-la immédiatement pour équilibrer à 37 °C (cela prendra ~2-3 min).
         2. Ajoutez les lymphocytes chargés de Fura2 au repos dans la chambre de la boîte de microscope montée à l’aide d’une pipette de 20 μl.
         3. Activez l’imagerie en champ clair. Sélectionnez le chemin de la lumière vers les oculaires. À l’aide du bouton de mise au point grossier, l’objectif est mis en contact avec le fond de la parabole du microscope. Utilisez l’oculaire et le bouton de mise au point fine pour faire la mise au point sur les lymphocytes T installés au fond de la parabole.
         4. Utilisez les commandes de scène x-y pour sélectionner un champ contenant au moins 10 cellules. Évitez les champs surpeuplés et les amas de cellules, car ils créeront des artefacts d’imagerie.
         5. Passez d’un champ lumineux à une source de lumière fluorescente. Passez de l’imagerie oculaire à la caméra CCD. Définissez les paramètres d’acquisition (par exemple, le temps d’exposition, le gain du détecteur et le binning). À l’aide du logiciel, acquérez des images Fura2-340 et Fura2-380 au repos (en commençant par un temps d’exposition identique pour chacun, généralement dans la plage de ~200-1 000 ms).
         6. Utilisez les méthodes décrites à l’étape 5.4.1 pour calculer le Fura2-340/Fura2-380 pour chaque lymphocyte. Effectuez des itérations répétées du réglage des temps d’exposition des Fura2-340 et Fura2-380, de l’acquisition d’images et du calcul des rapports jusqu’à ce que les valeurs moyennes soient proches de 1.
      2. Réglez les temps d’exposition pour mem-YFP et DsRed.
         1. Remplacer la parabole de microscope utilisée à l’étape 5.3.3.1 par une parabole de microscope contenant des HLMVEC ou des HDMVEC transfectés, activés et traités au SAg (ou non traités ; témoins) provenant de l’incubateur de culture cellulaire (étapes 4.5.1). À l’aide d’une pipette de transfert jetable, retirer rapidement le support, rincer une fois l’ajout de ~1 ml de Buffer-A préchauffé. Aspirez puis ajoutez 0,5 ml de Buffer-A.
         2. Identifier les champs dans lesquels des cellules endothéliales transfectant positives à la fluorescence brillante sont présentes et semblent saines avec des jonctions intercellulaires bien formées.
         3. Ajustez les paramètres d’acquisition (par exemple, le temps d’exposition, le gain du détecteur et le binning) pour mem-YFP et DsRed. Assurez-vous que l’intensité moyenne du signal de fluorescence dans chaque canal se situe entre 25 % et 75 % de la plage dynamique du détecteur.
4. Réaliser des expériences d’imagerie de cellules vivantes.
   1. Utilisez un logiciel automatisé pour commencer l’acquisition d’images et capturez plusieurs intervalles d’images pour établir une base de référence.
   2. Pendant l’acquisition, appliquer ~5 μl de lymphocytes concentrés chargés en Fura-2 (à partir de l’étape 5.2) au centre du champ d’imagerie de la parabole du microscope en insérant l’extrémité d’une pipette de petit volume (P-5 ou P-20) dans le milieu proche du centre de l’objectif et en éjectant lentement.
   3. Au fur et à mesure que les lymphocytes s’installent dans le champ d’imagerie, ajustez finement la mise au point pour vous assurer que l’interface entre les cellules T et les cellules endothéliales (synapses immunologiques) est maintenue dans le plan focal. Avec des objectifs 40 et 63X, ~10-20 cellules par champ sont optimales. Si moins de cellules sont observées dans le champ d’imagerie, répétez l’étape 5.3.4.2.
   4. Une fois l’intervalle d’observation souhaité de l’expérience terminé, poursuivre l’imagerie et pipeter immédiatement l’ionomycine directement dans la boîte du microscope (en utilisant la technique décrite au 5.3.4.2) jusqu’à une concentration finale de 2 μM pour induire un flux de calcium maximal/signal de signalisation Fura-2 (c’est-à-dire un moyen d’étalonnage, voir l’analyse 5.4.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Garrot sans latex extensible BD Vacutainer	BD Biosciences	367203
Tampons d’alcool BD	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Kit de prélèvement sanguin à bouton-poussoir	BD Biosciences	367335
Réf. RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	Référence : GE17-1440-02	Apporter à RT avant utilisation
FCS-Optima	Produits biologiques d’Atlanta	S12450	Chaleur inactivée
Pénicilline-streptomycine	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Trypan bleu	Sigma-Aldrich	Réf. T8154-20ML
Entérotoxine staphylococcique B	Technologie des toxines	BT202RED	Solution mère 1mg/ml dans du PBS
Toxine 1 du syndrome de choc toxique	Technologie des toxines	TT606RED	Solution mère 1mg/ml dans du PBS
IL-15 humaine	Systèmes de R&D	Référence 247-IL-025	Solution mère 50ug/ml dans du PBS
Pbs	Technologies de la vie	Référence 10010-049
Fibronectine	Technologies de la vie	Référence 33016-015	Solution mère 1mg/ml dans H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Cellules endoscopiques	Lonza	CC-2543	D’autres CE microvasculaires humaines peuvent être utilisées, c’est-à-dire les HLMVEC
Kit de balles EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
Trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	Réf. T-4174	Solution mère 10x, diluée dans du PBS
Kit Nucléofecteur Amaxa-HMVEC-L	Lonza	VPB1003	Kit requis pour l’étape 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Solution mère 1mg/ml dans H20
TNF-alpha 10ug, humain	Technologies de la vie	PHC3015	Solution mère 1mg/ml dans H20
HBSS sans rouge de phénol	Technologies de la vie	Référence 14175-103
Hepes	Fisher Scientific	Réf. BP299-100
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	Réf. C1016-100G	Solution mère 1M dans H20
chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	208337	Solution mère 1M dans H20
Albumine sérique humaine	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F sans fluorescence Huile d’immersion	Fisher Scientific	Référence 12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Technologies de la vie	Réf. F1221	Solution mère 1mM dans du DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	Référence 6917-1
Monomère pDsRed (DsRed cytoplasmique soluble)	Clontech	632466
Membrane monomère pDsRed (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-actine	Clontech	Référence 6116-1
Alexa Fluor 488 Phalloïdine	Technologies de la vie	N° A12379
Falcon 15mL Tubes à centrifuger coniques	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50mL Tubes de centrifugation coniques	Fisher Scientific	Référence 14-959-49A
Flacons traités pour la culture tissulaire Falcon T25	Fisher Scientific	Référence 10-126-9
Flacons traités pour la culture tissulaire Falcon T75	Fisher Scientific	Tél. : 13-680-65
Culture cellulaire Corning traitée T175	Fisher Scientific	Référence 10-126-61
Lamelles en verre	Fisher Scientific	Tél. : 12-545-85	Diamètre 12 mm
Plaques de culture tissulaire Falcon 24 puits	Fisher Scientific	Référence 08-772-1
Plaques Delta-T	Bioptechs	Référence 04200415B
Pipettes Pasteur jetables Wheaton	Fisher Scientific	13-678-8D
Tube Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	Référence : 05-402-25
Souris ICAM1 anti-humaine	BD Biosciences	555509
HS1 souris anti-humaine	BD Biosciences	610541
CD11a anti-humain (LFA-1alpha) purifié	Ebioscience	BMS102
CD3 Alexa Fluor® 488 Anti-Humain	Ebioscience	Référence 53-0037-41
Anticorps anti-CMH de classe II	Abcam	AB55152
Anticorps anti-Talin 1	Abcam	AB71333
Anticorps thêta anti-PKC	Abcam	AB109481
Phosphotyrosine (4G10 Platine)	Millipore	Tél. : 50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Électroporateur requis pour l’étape 4
Zeiss Axiovert	Micro-imagerie Carl Zeiss
Zeiss LSM510	Micro-imagerie Carl Zeiss
Logiciel Zeiss Axiovison	Micro-imagerie Carl Zeiss
NU-425 (série 60) Enceinte de sécurité biologique	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C, 5 % CO2 Incubateur de culture cellulaire	Fisher Scientific	Référence 202370
Centrifugeuse 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hémocytomètre	Sigma-Aldrich	Z359629	Hémocytomètre à lignes claires
Bain-marie Isotemp modèle 202	Fisher Scientific	Référence 15-462-2