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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Modèle murin transgénique de développement du cancer du sein
- Observez les souris du modèle de cancer souhaité pour la croissance tumorale appropriée via la palpation ou la mesure du pied à coulisse avant de continuer.
note: Ici, le modèle murin transgénique de développement du cancer du sein (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) a été utilisé. Ces animaux développent spontanément des carcinomes mammaires invasifs entre 6 et 12 semaines dans chaque glande mammaire. Des glandes mammaires normales ont été utilisées comme témoins chez les compagnons de portée transgéniques négatifs et du même âge.
2. Injection intraveineuse d’agents anticorps spécifiques et non spécifiques
- Purifier les anticorps anti-souris B7-H3 et IgG (immunoglobulines G) de lapin sur une colonne de dessalage (p. ex.,-10) pour éliminer les conservateurs et les tampons de stockage en suivant les instructions du fabricant.
note: Certains anticorps peuvent nécessiter une purification supplémentaire avec un protocole basé sur des billes d’agarose de protéine A.
- Dosages aliquotes de 33 μg de chaque conjugué d’anticorps dans des tubes de microcentrifugation individuels.
note: La posologie de l’agent administré peut varier en fonction de l’application et correspond aux doses auxquelles le conjugué d’anticorps est couramment utilisé. La concentration des solutions d’anticorps est nécessaire si le volume est supérieur à 100 μL pour la sécurité animale.
- Au moment souhaité avant le prélèvement de tissus, ici 96 h, anesthésez l’animal porteur de la tumeur avec 2 % d’isoflurane circulant dans de l’oxygène à 2 L/min, et placez-le sur une platine chauffée à 37 °C. Faites un pincement des orteils pour vous assurer que le bon niveau d’anesthésie a été atteint avant la procédure.
- Pour préparer l’inoculation des solutions d’anticorps dans la veine de la queue, désinfectez la queue de l’animal en l’essuyant trois fois avec une lingette imbibée d’alcool. Dilater les veines de la queue en les réchauffant à l’aide d’un coussin chauffant pendant environ 30 secondes. Évitez de chauffer l’animal entier. Essuyez à nouveau la queue avec une lingette imbibée d’alcool après avoir retiré le coussin chauffant.
- À l’aide d’un cathéter veineux de queue 27G, insérez l’aiguille papillon dans l’une des deux veines latérales de la queue et fixez soigneusement la queue avec l’aiguille insérée à la platine à l’aide d’un morceau de ruban chirurgical.
note: Un reflux sanguin visible dans le cathéter indique l’emplacement correct de l’aiguille dans la veine de la queue.
- Rincer le cathéter avec 25 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, puis injecter la solution d’anticorps dans le cathéter à l’aide de seringues à insuline. Rincez à nouveau le cathéter avec 25 μL de PBS stérile.
- Retirez l’aiguille de la queue et appliquez une pression pour arrêter tout saignement.
- Éteignez l’anesthésie et observez l’animal jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé pour tout signe de détresse.
3. Collecte et préparation des tissus tumoraux cibles
- Au moment souhaité, euthanasier l’animal sans cruauté conformément à la procédure institutionnelle acceptable, ici, par inhalation progressive de 100 % deCO2 à partir d’un réservoir de gaz comprimé avec un débit de déplacement de chambre de 10 à 30 % en volume/min.
note: Certaines applications de la technique IVIL nécessitent l’euthanasie par perfusion cardiaque avec PBS pour éliminer les anticorps circulant librement.
- Après confirmation de l’euthanasie sans cruauté par l’arrêt des mouvements respiratoires et cardiaques, l’absence de réponse par pincement des orteils et le grisonnement des muqueuses, exciser les tissus tumoraux à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces comme suit :
- Allongez la souris en position couchée et en saisissant uniquement la couche externe de la peau entre l’ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue (5ème) avec des pinces, faites une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.
- Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane sous-jacente de la paroi abdominale en la gardant intacte.
- Faites une incision verticale le long de l’abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre la 3ème et la 4ème glande mammaire, faites une coupe horizontale à travers l’abdomen pour permettre la rétraction de la peau et la visualisation des glandes mammaires.
note: Les tumeurs et les glandes mammaires sont situées superficiellement sous la peau.
- En saisissant chaque tumeur ou glande normale à l’aide d’une pince, coupez soigneusement la peau attachée à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Placez les moules excisés dans des moules de base jetables en tissu, pré-étiquetés et remplis d’un support d’enrobage à température de coupe optimale (OCT), et congelez rapidement les moules en les plaçant sur de la glace sèche. Afin d’étudier l’administration hors cible, exciser d’autres tissus ou organes d’intérêt (par exemple, le foie ou les poumons).
note: Pour interrompre le protocole à ce stade, conservez les blocs de tissus congelés à -80 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à continuer.
- À l’aide d’un cryostat, sectionnez des blocs de tissus congelés d’une épaisseur de 10 μm et placez les sections adjacentes sur des lames de verre d’adhérence pré-étiquetées.
note: Pour mettre le protocole en pause à ce stade, stockez les lames à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à continuer.
4. Protocole de coloration ex vivo
REMARQUE : Pour la comparaison quantitative entre les images de microscopie à fluorescence, toutes les lames sont colorées en même temps avec les mêmes solutions préparées.
- Rincez les lames de tissu congelées avec du PBS à température ambiante pendant 5 minutes pour éliminer l’OCT.
- Délimitez les coupes de tissus à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe pour réduire le volume de solutions nécessaires lors de la coloration.
note: Veillez à ne pas laisser le stylo passer sur les échantillons de tissus, car cela pourrait soit retirer le tissu de la lame, soit empêcher une coloration appropriée sur la partie tissulaire affectée. Ne laissez pas les sections de tissu se déshydrater à aucun moment.
- Fixez les sections de tissu avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 5 min.
- Rincer les lames dans du PBS pendant 5 min.
- Perméabiliser des coupes de tissus avec 0,5 % de Triton-X 100 dans du PBS pendant 15 min.
- Rincer les lames dans du PBS pendant 5 min.
- Bloquez les tissus avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % p/v et du sérum de chèvre à 5 % v/v, tous deux dans du PBS (solution bloquante) pendant 1 h à température ambiante.
note: Faites correspondre le sérum de solution bloquante à l’animal hôte de l’anticorps secondaire.
- Rincer les lames dans du PBS pendant 5 min.
- Incubez des coupes avec des anticorps primaires consignés au besoin, peut-être un marqueur nucléaire (p. ex., DAPI), vasculaire (p. ex., CD31) ou cytoplasmique (p. ex., actine) commun. Ici, l'anti-souris CD31 (marqueur vasculaire) chez le rat à une dilution de 1:100 a été utilisé selon les instructions du fabricant dans la solution bloquante pendant la nuit à 4 °C à l'abri de la déshydratation sur un plateau de lames.
note: N’ajoutez pas d’anticorps primaires ou de conjugués d’anticorps supplémentaires. Le conjugué qui a été injecté et laissé s’accumuler dans les tissus in vivo agit comme l’anticorps primaire.
- Rincez les lames dans PBS pendant 5 minutes trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.
- Incuber des lames avec des anticorps secondaires pour marquer les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l'anticorps anti-B7-H3 à l'aide de l'anticorps conjugué anti-lapin de chèvre AlexaFluor-546 (dilution 1:200, optimisée selon les instructions du fabricant) et CD31 avec l'anticorps secondaire anti-rat de chèvre AlexaFluor-488 (dilution 1:200, optimisée selon les instructions du fabricant) dans une solution bloquante, à l'abri de la lumière et de la déshydratation sur un plateau à lames, pendant 1 h à température ambiante.
note: Les anticorps secondaires proviennent du même animal hôte, mais correspondent à l’affinité des anticorps secondaires par rapport à l’espèce hôte de l’anticorps primaire respectif. Les lames sont protégées de la lumière à partir de ce point.
- Rincez les lames dans PBS pendant 5 minutes trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.
- Appliquez une goutte du support de montage au centre de la tranche de tissu et placez soigneusement une lamelle pour éviter de piéger les bulles d’air.
- Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent et laissez sécher.
note: Pour mettre le protocole en pause pendant une semaine au maximum, stockez les lames à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à continuer.
5. Imagerie par microscopie confocale et analyse quantitative d’images
REMARQUE : La préparation du microscope confocal et des paramètres d’imagerie dépendra du système confocal utilisé. Le microscope utilisé ici a été acheté dans le commerce (par exemple, le système Zeiss LSM 510 Meta) et le logiciel d’acquisition associé a été utilisé (par exemple, Zen 2009). Cependant, bon nombre de ces étapes s’appliqueront à n’importe quel microscope confocal et supposeront des connaissances de base en microscopie confocale.
- Une fois le système allumé et réchauffé, sélectionnez l’objectif souhaité ; ici, un objectif 20x (ouverture numérique = 0,8) a été utilisé.
- Chargez une glissière de commande positive, lamelle vers le bas, pour permettre de régler l’optimisation du signal le plus lumineux. Imagerie dans le canal rouge, focalisez le système sur l’échantillon en mode d’imagerie en direct.
- Pour chaque canal laser utilisé, optimisez l’intensité laser, le gain principal et la taille du sténopé comme suit :
- Passez en mode continu pour l’imagerie.
- Optimisez les barres de défilement de l’intensité laser (qui contrôle la puissance du laser) et du gain (maître) (qui contrôle la tension du tube photomultiplicateur) tout en surveillant l’histogramme de la table de recherche (LUT). Ajustez ces deux paramètres jusqu’à ce que la plage dynamique de l’histogramme soit remplie sans saturer les pixels.
note: Si l’intensité du laser est trop élevée, un photoblanchiment se produira. Si le Gain (Master) est trop élevé, l’image deviendra bruyante. Idéalement, le Gain (Master) se situera au milieu de sa gamme.
- Réglez le sténopé sur 1 unité d’air (AU), ce qui donne la résolution la plus élevée et la tranche z la plus fine.
- Faites glisser la barre de décalage numérique pour réduire le bruit de fond sur l’histogramme LUT et obtenir un arrière-plan noir véritable.
note: Une fois que les paramètres de microscopie sont optimisés pour chaque canal laser et objectif, maintenez-les constants tout au long de la séance d’imagerie et pour l’imagerie de toutes les lames, afin de permettre la comparaison quantitative entre les lames.
- Sous l’onglet Mode d’acquisition, sous Calcul de la moyenne, sélectionnez le nombre et la profondeur de bits souhaités. Cliquez sur le bouton Optimal pour définir la taille de pixel optimale.
- Utilisez le bouton d’acquisition Snap pour collecter une image de haute qualité. Ici, des champs de vision aléatoires ont été sélectionnés à l’intérieur de la tumeur, mais d’autres zones d’intérêt peuvent s’appliquer à différentes applications (vaisseaux, marges tumorales, profondeur de pénétration, etc.)
- Enregistrez les fichiers d’image dans le format utilisé par le logiciel confocal (ici, « .lsm ») pour le traitement et la quantification hors ligne.
note: Si toutes les diapositives ne sont pas imagées au cours de la même session, enregistrez les paramètres et rechargez-les lors des visites suivantes, bien qu’il ne soit pas recommandé de réimager la même diapositive en raison du photoblanchiment.
- Effectuer les mesures quantitatives de l’intensité de fluorescence. Ouvrez Fiji (Fiji Is Just ImageJ software) et chargez un fichier image .lsm en le faisant glisser sur la barre d’état.
- Divisez les données de la couche de couleur. Allez dans Piles de > d’images > Diviser les canaux.
- Prétraitez les images de fluorescence selon vos besoins, c’est-à-dire soustrayez le signal de fond (Traiter > Soustraire l’arrière-plan) ou réduisez le bruit via une méthode de filtrage.
- Segmentez le canal de couleur correspondant à la protéine de référence (coloration vasculaire, nucléaire, cellulaire) en fixant un seuil sur l’intensité du signal (Image > Ajuster > Seuil).
note: Le seuillage manuel introduit de la subjectivité dans l’analyse d’image, par conséquent, l’utilisation d’un algorithme de seuillage automatisé ou le référencement d’histogrammes d’images rend les résultats d’analyse d’image moins biaisés.
- Utilisez ce seuil pour créer un masque binaire (Traiter > Binaire > Convertir en masque).
- Mesurez et étiquetez les zones d’intérêt dans le masque (Analyser > Analyser les particules > Cochez Ajouter au gestionnaire > OK).
- Appliquez des ROI au canal de couleur correspondant à l’anticorps d’intérêt (cliquez sur l’image du canal, Analyser > Outils > ROI Manager > Mesurer). Cela appliquera les zones d’intérêt du masque à l’image de l’anticorps et fournira des mesures d’image pour les sections d’étiquette dans la fenêtre Résultats. Fenêtre Enregistrer les résultats (Fichier > Enregistrer).
- Calculez la statistique d’intérêt souhaitée, telle que l’intensité moyenne de fluorescence, comme décrit ici.
- Effectuez toutes les étapes de traitement de la même manière que chaque image d’un ensemble de diapositives. Créez une macro pour effectuer automatiquement cette opération pour les lots d’images volumineux.
- Pour afficher l’image uniquement après des mesures quantitatives, appliquez des ajustements qualitatifs de l’image pour optimiser la visualisation des modèles de biodistribution en ajustant le minimum, le maximum, la luminosité et le contraste aux mêmes niveaux sur toutes les diapositives (Image > Ajuster > luminosité/contraste).
- Convertissez le type d’image (Type de > d’image > Couleur RVB) et enregistrez les fichiers dans un type d’image sans perte tel que .tiff (Fichier > Enregistrer sous > Tiff...) pour une utilisation dans des présentations et des publications.