Un immunodosage multiplex basé sur des billes pour identifier les anticorps spécifiques des agents pathogènes dans la salive

Abstract

Source : Augustine, S. A. J., et al. Développement d’un dosage immunologique multiplex d’anticorps salivaires pour mesurer l’exposition humaine aux agents pathogènes environnementaux. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo présente une technique d’immunodosage multiplex basée sur des billes pour détecter simultanément des anticorps contre plusieurs agents pathogènes environnementaux dans la salive humaine. Des billes fluorescentes ont été couplées à des antigènes de différents agents pathogènes, qui ont été capturés à l’aide d’anticorps dans l’échantillon de salive humaine. Lors du marquage des anticorps à l’aide d’un rapporteur fluorescent, les billes ont été analysées à l’aide de la cytométrie en flux pour évaluer la présence de différents anticorps spécifiques à l’agent pathogène dans la salive.

Protocol

1. Couplage de talon

1. Couplage des antigènes aux ensembles de billes en utilisant les concentrations indiquées dans le tableau 1.
2. Ajouter chaque antigène aux billes activées et porter le volume total à 500 μl en 50 mM MES, pH 5,0. Mélangez les antigènes et les billes par vortex.
3. Incuber les antigènes et les billes pendant 2 heures avec mélange par rotation (~15 tr/min) à température ambiante dans l’obscurité. Granuler les billes couplées par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
4. Retirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 500 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-albumine sérique bovine (BSA)-monolaurate de polyoxyéthylène sorbitan (Tween-20)-azoture de sodium (PBS-TBN) pH 7,4 par vortex et sonication. Granuler les billes par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min et retirer le surnageant.
   prudence: L’azoture de sodium est un produit chimique extrêmement toxique. Il est mortel s’il est avalé ou entre en contact avec la peau. Ne respirez pas la poussière/les fumées/les gaz/brouillards/vapeurs ou les aérosols. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous le manipulez et vous en éliminez conformément aux lois appropriées.
5. Remettre les billes en suspension dans 1 ml de PBS-TBN par vortex et sonication pendant 20 sec.
6. Granuler les billes par microcentrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
7. Répétez les étapes 1.5 et 1.6.
   note: Cela donne un total de deux lavages avec PBS-TBN.
8. Remettre en suspension les billes couplées et lavées dans 1 ml de PBS, 1 % BSA, 0,05 % Azide, pH 7,4. Conservez les billes couplées dans un réfrigérateur à 2-8 °C dans l’obscurité.

2. Dosage immunologique multiplex salivaire

1. Retirez la salive du congélateur à -80 °C et laissez-la décongeler à température ambiante.
2. Remettre en suspension les billes couplées à l’antigène par vortex et sonication pendant 20 sec.
3. Préparez un mélange de billes de travail en diluant les stocks de billes couplés à une concentration finale de 100 billes/μl de chaque ensemble de billes unique dans un tampon PBS-1 % BSA.
4. Préparez une dilution 1:4 de la salive avec un tampon PBS-1 % BSA dans une plaque à puits profond de 96 puits.
5. Pré-mouillez la plaque filtrante avec 100 μl de tampon de lavage et retirez le surnageant par aspiration.
6. Ajouter 50 μl d’un mélange de billes de travail et un volume égal de salive diluée à 95 puits des plaques filtrantes à 96 puits pour une dilution finale de 1:8. Mélangez les réactions avec un pipeteur multicanaux. Dans le puits de contrôle, ajoutez 50 μl de billes couplées à l’antigène et 50 μl de tampon PBS-1 % BSA (en remplacement de la salive).
7. Couvrir et laisser incuber à l’obscurité à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur de microplaques à 500 tr/min. Éliminer le surnageant par aspiration. Lavez les puits avec 100 μl de tampon de lavage et éliminez le surnageant par aspiration. Répétez le lavage 1x.
8. Remettez en suspension les billes dans 50 μl de PBS-1 % BSA avec une pipette multicanaux.
9. Diluer l’anticorps de détection secondaire IgG humain de chèvre biotinylé à 16 μg/ml dans PBS-1 % BSA.
10. Ajoutez 50 μl d’anticorps secondaires dilués dans chaque puits et mélangez le contenu avec un pipeteur multicanaux.
11. Couvrez la plaque filtrante et laissez-la incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur à plaques. Éliminer le surnageant par aspiration. Lavez les puits avec 100 μl de tampon de lavage et éliminez le surnageant par aspiration. Répétez le lavage 1x.
12. Remettez en suspension les billes dans 50 μl de PBS-1 % BSA avec une pipette multicanaux.
13. Diluer la streptavidine-R-phycoérythrine rapporteure (SAPE) à 24 μg/ml dans PBS-1 % BSA.
14. Ajouter 50 μl de rapporteur dans chaque puits et mélanger avec un pipeteur multicanaux.
15. Couvrez la plaque filtrante et laissez-la incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur à plaques. Éliminer le surnageant par aspiration. Lavez les puits avec 100 μl de tampon de lavage et éliminez le surnageant par aspiration. Répétez le lavage 1x.
16. Remettre en suspension les billes dans 100 μl de PBS-1 % BSA et analyser 50 μl à l’aide de l’analyseur.
    note: Les résultats de l’immunodosage multiplex sont mesurés en unités d’intensité de fluorescence médiane (MFI). Référez-vous toujours à la dernière version du manuel du logiciel, le cas échéant, pour éviter les erreurs.

Tableau 1 : Mélange de billes de travail pour l’immunodosage multiplex.Une fois l’accouplement et la confirmation terminés, un mélange principal composé de chaque jeu de billes a été préparé comme indiqué. Le mélange maître a été réparti entre tous les puits de la plaque de 96 puits. Tous les puits ont été incubés avec de la salive, à l’exception d’un puits témoin d’arrière-plan qui ne contenait que des billes et un tampon BSA PBS-1 %.

antigène	Jeu de perles	Tampon de couplage	Concentration en Ag (μg)	# de perles dans 1 coin	# de billes/μl	Vol. pour 100 B/uL pour 4 ml (μl)
C. jejuni	8	MES 5.0	50	64	6 400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7 100	85
hépatite A	42	MES 5.0	100	91	9 100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8 500	71
Norovirus GII.4	55	MES 5.0	5	72	7 200	83
Norovirus GI.1	67	MES 5.0	5	63	6 300	95
Découplé	80	MES 5.0		60	6 000	100
		Volume total des billes (μl)				594
		Volume total de tampon nécessaire (μl)				3 406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Équipement et logiciels
Microcentrifugeuse	Thermo Electron Corporation	75002446	Utilisé pour centrifuger des échantillons
Mélangeur Vortex	VWR	G560	Utilisé pour mélanger des échantillons
Sonicateur (mini)	Fisher Scientific	Tél. : 15-337-22	Utilisé pour séparer les billes
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	divers
Collecteur à vide multi-écrans	Millipore	MSVMHTS00	Utilisé dans les étapes de lavage pour éliminer le surnageant
Micro-secoueur	VWR	Référence 12620-926	Utilisé pour agiter les billes pendant les incubations
Porte-tubes (1,5 ml et 0,5 ml) (assortis)	VWR	Référence 30128 à 346
balance	Mettler ou autre		Utilisé pour mesurer les réactifs de lavage pour la fabrication de tampons
Mélangeur d’échantillons Dynabead	Invitrogen	Référence 947-01	Utilisé lors de l’étape d’incubation du couplage
MatLab (R2014b)	Le MathWorks, Inc.		Utilisé pour analyser les données de réponse des anticorps
Microsoft Excel 2014	Société Microsoft		Utilisé pour analyser les données de réponse des anticorps
Analyseur Luminex avec le logiciel xPonent 3.1	Société Luminex	LX200-XPON3.1	Instrument et logiciel utilisés pour effectuer le test
Antigènes
GI.1 Virus de Norwalk : particule p	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Hôpital pour enfants de Cincinnati. Conc. final 5 μg.
GII.4 Norovirus VA387 : particule p	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Hôpital pour enfants de Cincinnati. Conc. final 5 μg.
Virus de l’hépatite A : concentré de grade II issu de la culture cellulaire	Meridian Sciences de la vie	Référence 8505	Antigène couplé à 100 μg
Helicobacter pylori : lysat	Meridian Sciences de la vie	Réf. R14101	Antigène couplé à 25 μg
Toxoplasma gondii : p30 recombinant (SAG1)	Meridian Sciences de la vie	Réf. R18426	Antigène couplé à 25 μg
Campylobacter jejuni : la chaleur a tué des cellules entières	KPL	Référence 50-92-93	Antigène couplé à 50 μg
Anticorps primaires
Anti-norovirus cobaye	(CCHMC)*	Na	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
IgG anti-hépatite A de souris	Meridian Sciences de la vie	C65885M	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
IgG anti-hépatite A de souris	Meridian Sciences de la vie	C65885M	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
BacTraceAffinity Anticorps purifié contre Helicobacter pylori	KPL	Référence 01-93-94	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
Du pAb de la chèvre à Toxoplasma gondii	Abcam	AB23507	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
BacTrace Chèvre anti-Campylobacter espèce	KPL	Référence 01-92-93	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
Anticorps secondaires
Biotine-SP-Conjuguée AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson	Tél. : 705-065-149	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
Lapin biotinylé anti-IgG de chèvre (H+L)	KPL	16-13-06	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
Chèvre biotinylée anti-IgG de souris (H+L)	KPL	18/16/06	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
Anticorps purifié d’affinité IgG (H+L) de chèvre marqué à la biotine	KPL	176-1506	Utilisé pour la confirmation de l’accouplement
Anticorps purifié d’affinité IgG de chèvre marqué à la biotine anti-IgG humaines (γ)	KPL	16-10-02	Utilisé pour le dosage immunologique salivaire
Consommables
Tubes microcentrifuges en copolymère de 1,5 mL	Scientifique américain	Référence 1415-2500	Utilisé comme tubes de microcentrifugation à faible liaison
Recharges d’embouts de pipette de 10 μL	BioVentures	Référence 5030050C
Recharges d’embouts de pipette de 200 μL	BioVentures	Référence 5030080C
Recharges d’embouts de pipette de 1000 μL	BioVentures	Référence 5130140C
Aluminium	Divers fournisseurs		Utilisé pour garder les billes dans l’obscurité pendant les incubations
Plaques à puits profonds	VWR	Réf. 40002-009	Utilisé pour diluer des échantillons de salive
Plaques filtrantes multi-écrans	Millipore	MABVN1250	Utilisé pour effectuer des tests
Système de collecte de salive Oracol	Malvern Medical Developments Limited		Utilisé pour le prélèvement de salive
Réactifs
Microsphères carboxylées (billes)	Société Luminex	Dépend du jeu de perles	Les antigènes sont couplés aux microsphères
EDC (chlorhydrate de carbodiimide de 1-éthyl-3-[3diméthylaminopropyl])	percer	77149 ou 22980	Utilisé dans l’activation des billes
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	percer	Référence 24510	Utilisé dans l’activation des billes
Steptavidin-R-phycoérythrine (1 mg/mL)	Sondes moléculaires	S-866	Utilisé comme rapporteur
MES (acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique)	sigma	M-2933	Utilisé pour l’accouplement
Tween-20 (monolaurate de polyoxyéthylènesorbitan)	sigma	P-9416	Utilisé dans le tampon de lavage pour éliminer les liants non spécifiques
Tampons protéiques
Tampon de blocage/stockage PBS-TBN (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % Azide, pH 7,4)**			Filtrer Stériliser et conserver à 4°C
PBS, pH 7,4	sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
Bsa	sigma	A-7888	0,1 % (p/v)
Préadolescent-20	sigma	P-9416	0,2 % (v/v)
Azoture de sodium (0,05 % d’azoture)**	sigma	S-8032	**Attention : L’azoture de sodium est extrêmement toxique. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Portez des EPI appropriés. Disposer conformément aux lois applicables.
MES/tampon de couplage (0,05 m MES, pH 5,0)
MES (acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique)	sigma	S-3139
5 N NaOH	pêcheur	SS256-500
Tampon d’essai (PBS, 1 % BSA, pH 7,4)			Filtrer Stériliser et conserver à 4°C
PBS, 1 % BSA, pH 7,4	sigma	P-3688	138 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1 % BSA
Tampon d’activation (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)			Filtrer Stériliser et conserver à 4°C
NaH2PO4 (Phosphate de sodium, monobasique anhydre)	sigma	S-3139	0,1 M NaH2PO4
5 N NaOH	pêcheur	SS256-500
Tampon de lavage (PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4)			Filtrer Stériliser et conserver à 4°C
PBS, 0,05 % Tween-20, pH 7,4	sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05 % DOUZE