Mesure quantitative par cytométrie en flux de la phagocytose fongique des spores par les phagocytes humains

Résumé

Source : Hartung, S., et al., Mesure de la phagocytose des conidies d’Aspergillus fumigatus par les leucocytes humains à l’aide de la cytométrie en flux. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente une méthode de quantification de la phagocytose des spores fongiques pathogènes marquées au FITC par les leucocytes humains. Les spores phagocytées sont discernées des spores adhérentes aux cellules par contre-coloration, suivie d’une analyse cytométrique en flux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Dosage de la phagocytose

1. Incuber 2 x 10⁶ leucocytes et 4 x 10^conidies marquées au FITC (multiplicité de l’infection = 2) dans 1,5 mL de RPMI + 10 % de FCS dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits. En tant que témoins, incluez uniquement les cellules (pas de conidies) et les cellules + conidies non étiquetées.
2. Placer dans un incubateur de CO₂ humidifié à 37 °C et incuber pendant la période souhaitée (par exemple, 0,5 h, 2 h ou 4 h).
3. Après l’incubation, prélever les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et les mettre dans un tube de 15 ml.
4. Essorer pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
5. Prélever le surnageant pour l’analyse des cytokines ou le jeter si vous ne le souhaitez pas. Remettre chaque échantillon en suspension dans 100 μL de PBS + 2 mM d’EDTA.

2. Coloration des anticorps

1. Pour chaque échantillon, préparer 100 μL de mélange d’anticorps, y compris l’anticorps anti-FITC APC, conformément au tableau 1.
2. Placez un échantillon de 100 μL dans un puits d’une plaque à fond en V de 96 puits. Ajouter 150 μL de PBS + 2 mM d’EDTA pour le lavage.
3. Pour la compensation des couleurs, placez 1 x 10⁶ cellules pour chaque couleur dans d’autres puits de la plaque inférieure en V à 96 puits. Incluez un puits de cellules qui n’est pas coloré. Ajouter 150 μL de PBS + 2 mM d’EDTA pour le lavage.
4. Couvrez la plaque d’une feuille adhésive.
5. Essorer pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Retirez le papier d’aluminium.
6. Jetez le surnageant en ne retournant rapidement et vigoureusement la plaque qu’une seule fois au-dessus de l’évier ou avec un essuie-tout jetable.
   REMARQUE : Ne répétez pas ou ne renversez pas la plaque sur un papier jusqu’à ce qu’elle soit sèche, car cela entraînerait une perte massive de cellules de la plaque.
7. Remettre les cellules en suspension dans le mélange d’anticorps de 100 μL et bien mélanger par pipetage.
8. Pour compenser la couleur, remettre les cellules respectives en suspension dans 100 μL de PBS + 2 mM d’EDTA et ajouter un seul anticorps à chaque puits à la même quantité que celle utilisée dans le mélange d’anticorps.
9. Couvrir d’une feuille adhésive et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité.
10. Retirez le papier d’aluminium. Ajouter 150 μL de PBS + 2 mM d’EDTA dans chaque puits pour le lavage. Couvrir d’une feuille adhésive.
11. Essorer pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Retirez le papier d’aluminium. Jetez le surnageant en renversant rapidement et vigoureusement l’assiette au-dessus de l’évier ou d’une serviette en papier jetable.
12. Remettre en suspension dans 200 μL de PBS + 2 mM d’EDTA et transférer les cellules de chaque puits dans un tube à fond rond séparé. Assurez-vous qu’il n’y a pas de groupes de cellules dans la suspension. Supprimer les clusters sinon.
    REMARQUE : Chaque grappe suffisamment grande pour que l’œil puisse la voir est assez grande pour potentiellement obstruer le cytomètre.

3. Cytométrie en flux

1. Démarrez le cytomètre en flux et laissez-le se réchauffer. Démarrez le logiciel d’acquisition.
2. Créez une nouvelle expérience, puis configurez et étiquetez les échantillons.
3. Configurez les paramètres (FSC 250, SSC 250) et les détecteurs pour les fluorophores FITC, APC, BUV395, V500 et PerCP-Cy5.5.
4. Configuration de la rémunération
   1. Ouvrez la configuration de la compensation.
   2. Indiquez les couleurs individuelles.
   3. À l’aide des cellules de contrôle laissées non colorées ou avec des colorations individuelles, réglez les tensions du détecteur PMT pour inclure tous les événements de l’échelle.
   4. Enregistrez au moins 10 000 événements de chaque contrôle.
   5. Utilisez la configuration de compensation pour calculer le débordement des fluorophores et appliquez-le aux paramètres du cytomètre de l'expérience.
5. Enregistrement des données d’échantillon
   1. Affichez le FSC et le SSC dans le logiciel d’acquisition et placez une porte autour des leucocytes.
   2. Sur la base de la porte leucocytaire, affichez le diagramme à points SSC/CD45 et la porte pour les cellules CD45⁺ à séparer des conidies.
   3. Affichez les cellules CD45⁺ dans un graphique à points CD14/CD66b et les monocytes de grille (CD14⁺) et les neutrophiles (CD66b⁺) séparément.
   4. Affichage des neutrophiles dans un graphique à points anti-FITC/FITC.
   5. En utilisant l’échantillon avec des conidies non marquées, définissez des quadrants pour les signaux anti-FITC et FITC, en autorisant un maximum de 1 % de cellules dans les quadrants respectifs.
   6. Répétez les étapes 3.5.4 et 3.5.5 pour la porte monocytaire.
   7. Enregistrez tous les échantillons comportant au moins 20 000 événements dans la porte leucocytaire.

Tableau 1 : Mélange d’anticorps pour la cytométrie en flux. Les quantités de chaque réactif sont données sous forme de microlitres par échantillon (1 x 10⁶ cellules) à analyser.

Réactif	μl par échantillon
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0,5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
APC anti-FITC	0,5
PBS + 2 mM EDTA	97
total	100

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feuille adhésive	marque	701367
Plaque de culture cellulaire, 12 puits	Greiner Bio-one	Référence 665180
Cytomètre	BD Biosciences		LSR Fortessa II, lasers : 488 nm (bleu), 405 nm (violet), 355 nm (UV) et 640 nm (rouge)
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM en PBS
Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM dans une solution Na2CO3/PBS
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	ThermoFisher Scientific	Référence 189012-014	Sans calcium, sans magnésium
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	61870010	RPMI 1640 Moyen, Supplément GlutaMAX
Logiciel d’acquisition et d’analyse de données	BD Biosciences
Plaque inférieure en V, 96 puits	marque	781601	Surface non traitée
Formaldéhyde	Carl Roth	PO87.3	Histofix