Un test d’immunofluorescence pour caractériser et quantifier les granules de stress chez les mammifères

Résumé

Source : Aulas, A. et al., Méthodes pour classifier les foyers cytoplasmiques en tant que granules de stress chez les mammifères.J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente un test de caractérisation et de quantification des granules de stress chez les mammifères, qui sont constitués d’ARNm, de protéines de liaison à l’ARN (RBP) et de diverses autres protéines.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Ajouter des lamelles de recouvrement autoclavées à 12 puits d’une plaque de 24 puits, comme l’indique la figure 1A, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile fixée à un vide pour prélever chaque lamelle. Tapotez doucement la lamelle sur le côté du puits pour libérer l’aspiration, permettant à la lamelle de tomber dans le puits.
2. Plaque 1 x 10⁵ cellules d’ostéosarcome U-2 OS (U2OS) par puits à un volume final de 500 μL de milieu. Déplacez la plaque d’un côté à l’autre et de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties.
3. Appuye....

Résultats

Figure 1 : Diagrammes expérimentaux. (A) Ensemencer les cellules sur des lamelles préalablement placées dans une plaque à 24 puits, comme indiqué. Traiter les rangées A et B pendant 60 minutes avec de l’AS ou du VRB en utilisant la concentration en μM indiquée dans la mesure indiquée. Après 60 min, ajouter du CHX (concentration finale : 20 μg/mL pour la colonne 2) ou du puro (.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’exploitation U-2	ATCC	ATCC®HTB-96™	- communément écrit « U2OS" - culture à 37 °C sous 5 % de CO2 dans 10 % de FBS/DMEM
La modification par Dulbecco du médium d'Eagle	Corning	10-013-CV	- abrégé DMEM - contient 4,5 g/L de glucose, de pyruvate et de phénol rouge - complété par 10 % de FBS, 10 mM d’HEPES et de la pénicilline/steptomycine - Préchauffage Dilution du (des) médicament(s) antérieur(s - préchauffage de la dilution du ou des médicaments antérieurs
Sérum fœtal bovin	sigma	F2442-500ml	- abrégé FBS - utilisé pour compléter les milieux
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	Référence 15630-080	- utilisé pour compléter les milieux
Pénicilline Streptomycine	sigma	P0781-100ml	- utilisé pour compléter les milieux
Plaque à 24 puits	Costar	Référence 3524
Tissus de laboratoire	SCIENCE KIMTECH	Référence 34120	- communément appelé « Kimwipes »
Coverglass pour verres de croissance	Fisher Scientific	Tél. : 12-545-82	- autoclavé avant utilisation - Conserver stérile dans le capot de culture tissulaire
(méta)arsénite de sodium ≥90 %	sigma	S7400-100G	- communément appelé arsénite de sodium et abrégé SA - dissolution dans l’eau à une concentration de 1 M, puis dilution à 100 μM sous forme de matière première
Vinorelbine	TSZ CHEM	Réf. RS055	- abrégé VRB - dissoudre dans l’eau à 10 mM
Puromycine	sigma	P9620	- Utilisé pour évaluer le niveau de traduction (ribopuromycylation) - utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active - diluer dans l’eau à 10 mg/mL
Hydrate de dichlorhydrate d’émétine	sigma	E2375	- Utilisé en combinaison avec Puro pour évaluer le niveau général de traduction - utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active - diluer dans l’eau à 10 mg/mL
Cycloheximide	sigma	Réf. C4859	- abrégé CHX - utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active - diluer dans l’eau à 10 mg/mL
Saline tamponnée au phosphate	Lonza / VWR	Référence 95042-486	- abrégé PBS - tampon de lavage pour l’immunofluorescence
Réactif de paraformaldéhyde, cristallin	sigma	P6148-500G	- faire une solution à 4 % dans du PBS chaud dans la hotte, remuer jusqu’à dissolution - les aliquotes peuvent être conservées à - 20 °C pendant plusieurs mois - dangereux, utilisez la ventilation - jeter avec les déchets spéciaux
Méthanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- pré-refroidi à -20°C avant utilisation - jeter avec les déchets spéciaux
Sérum de cheval normal	Thermo Fisher Scientific	Référence 31874	- en abrégé NHS - diluer à 5 % en PBS - ajouter de l’azoture de sodium pour le stockage à 4°C - solution bloquante pour l’immunofluorescence
Éthanol, pur, 200 Proof (100 %),USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	Référence 89125-188	- diluer à 70 % avec de l’eau
Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope	Fisherbrand	Référence 12-550-15
Anticorps anti G3BP1 de souris (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- conserver à 4 °C - Utilisation à une dilution de 1/100
Anticorps anti eIF4G de lapin (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- conserver à 4 °C - Dilution de 1/250
Anticorps anti-eIF3η (N-20) de chèvre	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η est également connu sous le nom de eIF3b - conserver à 4 °C - Dilution de 1/250
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-souris IgG (H+L)	Jackson Immunorecherche	Tél. : 715-225-150	- se reconstituer dans l'eau selon les instructions du fabricant puis conserver à 4°C - Dilution de 1/250
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Lapin IgG (H+L)	Jackson Immunorecherche	Tél. : 711-165-152	- se reconstituer dans l'eau selon les instructions du fabricant puis conserver à 4°C - Dilution 1/2500
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunorecherche	Tél. : 705-175-147	- se reconstituer dans l'eau selon les instructions du fabricant puis conserver à 4°C - Dilution de 1/250
La solution Hoechst 33258	sigma	Référence 94403-1ML	- incuber avec une solution mère d’anticorps secondaires 0,5 mg/mL dans dH20, protéger de la lumière- Conserver à 4 °C
20 x tampon SSC	Thermo pêcheur Ambion	AM9763	- diluer à 2X SSC en utilisant de l’eau libre RNase (traitée au DEPC)- stocker à température ambiante- tampon de lavage pour FISH
Support de montage de glissière	fait maison	/	- mélanger 5 g de poly(alcool vinylique) « soluble à froid » dans 20 ml de PBS- mélanger par sonication, suivi d’un brassage pendant une nuit à RT- Ajouter 5 ml de glycérol et 0,2 ml d’azoture de sodium à 20 %, et agiter pendant 16 h à RT- centrifugation à 20 000 g pendant 20 min, jeter les gros granulés- aliquote liquide visqueux, conservation à long terme à -20°C, 1 semaine à 4°C
Parafilm « M »	sigma	P7793-1EA	- Généralement appelé « parafilm »
Poly(alcool vinylique)	sigma	P-8136-250G	- réactif pour faire du vinol
glycérol	sigma	G5516-100ML	- réactif pour faire du vinol
Azoture de sodium	Fisher Scientific	S2002-5G	- agent de conservation pour solution bloquante et Vinol - faire une dilution de 20 % dans l’eau