Un test d’immunofluorescence pour caractériser et quantifier les granules de stress chez les mammifères

Résumé

Source : Aulas, A. et al., Méthodes pour classifier les foyers cytoplasmiques en tant que granules de stress chez les mammifères.J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente un test de caractérisation et de quantification des granules de stress chez les mammifères, qui sont constitués d’ARNm, de protéines de liaison à l’ARN (RBP) et de diverses autres protéines.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Ajouter des lamelles de recouvrement autoclavées à 12 puits d’une plaque de 24 puits, comme l’indique la figure 1A, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile fixée à un vide pour prélever chaque lamelle. Tapotez doucement la lamelle sur le côté du puits pour libérer l’aspiration, permettant à la lamelle de tomber dans le puits.
2. Plaque 1 x 10⁵ cellules d’ostéosarcome U-2 OS (U2OS) par puits à un volume final de 500 μL de milieu. Déplacez la plaque d’un côté à l’autre et de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties.
3. Appuyez doucement sur les lamelles à l’aide d’une pointe P1000 propre pour vous assurer qu’elles se trouvent au fond du puits et qu’il n’y a pas de bulles sous la lamelle.

2. Cellules de stress

1. Le lendemain, vérifiez visuellement la plaque pour vous assurer que les cellules sont uniformément dispersées et uniformément confluentes sur la lamelle, car les variations entre les échantillons peuvent nuire à la reproductibilité des résultats. Utilisez un objectif 10X sur un microscope de culture tissulaire inversé.
2. Préchauffez le fluide à 37 °C. Évitez d’appliquer un fluide froid ou chaud sur les cellules, car ils provoquent respectivement un choc thermique ou un choc thermique.
3. Diluez les médicaments dans un milieu préchauffé. Pour chaque concentration de médicament différente, préparez 2 puits contenant 500 μL de milieu. Préparez 500 μL supplémentaires pour éviter les pertes lors du pipetage. Aliquote 4 tubes contenant chacun 1,5 mL.
   1. Pour l’arsénite de sodium : à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 1,5 μL de 100 mM d’arsénite de sodium (concentration finale : 100 μM) ou ajouter 0,75 μL de 100 mM d’arsénite de sodium (concentration finale : 50 μM).
   2. Pour la vinorelbine : dans chaque puits contenant 500 μL, ajouter 22,5 μL de 10 mM de vinorelbine (concentration finale : 150 μM) ou ajouter 18,75 μL de 10 mM de vinorelbine (concentration finale : 100 μM).
      note: L’arsénite de sodium est un inducteur de granules de stress bien caractérisé et couramment utilisé et est donc classiquement utilisé comme contrôle positif.
4. Retirez et jetez le média des puits B1 - 4 et C1 - 4. Ajoutez le milieu avec les médicaments et attendez 60 minutes (Figure 1A).
   1. Ajouter 500 μL de milieu avec 100 μM d’arsénite de sodium dans les puits B1 et B2. Ajouter 500 μL de milieu avec 50 μM d’arsénite de sodium dans les puits B3 et B4.
   2. Ajouter 500 μL de milieu avec 150 μM de vinorelbine dans les puits C1 et C2. Ajouter 500 μL de milieu avec 125 μM de vinorelbine dans les puits C3 et C4.
5. 30 min avant la fixation, traiter les puits de la colonne 2 avec 5 μL de cycloheximide (1 mg/mL de stock) et les puits de la colonne 4 avec 2 μL de puromycine (1,25 mg/mL de stock). Basculez doucement la plaque pour qu’elle mélange avant de la remettre dans l’incubateur à 37 °C.

3. Fixation cellulaire et immunofluorescence

REMARQUE : Avant l’expérience, assurez-vous que le méthanol est refroidi à -20 °C. Préparez des tampons, y compris une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 5 % de sérum de cheval normal (NHS) dans le PBS et 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS.

1. Jetez le support et lavez les puits contenant des lamelles avec du PBS. Selon les médicaments utilisés, il peut être important de jeter correctement les milieux contenant des médicaments ; Contactez le bureau local de la sécurité environnementale pour obtenir des instructions spécifiques. Pour laver efficacement, remplissez un flacon compressible de PBS, coupez l’embout afin de permettre un écoulement doux plutôt qu’un jet serré, et utilisez-le pour ajouter du PBS à chaque puits après avoir aspiré le PBS d’origine.
2. Fixez les cellules à l’aide de ~250 μL de PFA à 4 % pendant 15 min à température ambiante, RT sous agitation douce. Recouvrez complètement le haut de la lamelle avec du PFA ; 250 μL devraient suffire, mais si ce n’est pas le cas, ajoutez-en plus. Évitez toujours de pipeter directement sur les lamelles, car certaines cellules (ou traitements de stress des cellules) peuvent altérer la fixation, et la force du pipetage peut déloger les cellules.
3. Retirez le PFA et jetez-le correctement. Contactez le bureau local de la sécurité environnementale pour plus de détails sur la façon de jeter correctement le paraformaldéhyde.
4. Ajouter ~250 μL de méthanol (-20 °C) et incuber pendant 5 min à RT sous un léger balancement, ce qui perméabilise et aplatit les cellules.
5. Retirez et jetez le méthanol et bloquez les cellules en appliquant ~250 μL de NHS à 5 % pendant 1 h à RT pendant la nuit, O/N, à 4 °C. Contactez le bureau local de la sécurité environnementale pour plus de détails sur la façon de jeter correctement le méthanol.
6. Pour les anticorps primaires, diluer les anticorps dans 5 % de NHS.
   note: L’utilisation de plusieurs marqueurs SG est essentielle pour confirmer si les granules observés sont de véritables SG. Le nombre de marqueurs SG pouvant être utilisés dépend des filtres disponibles dans le microscope. Si des ensembles de filtres standard vert, rouge et rouge lointain sont disponibles, utilisez G3BP1, eIF4G et eIF3b à une dilution de 1/250.
   1. Pour cette expérience (12 lamelles à 250 μL chacune-Total : 3 mL de NHS à 5 %), ajoutez 12 μL de chacun des éléments suivants : anti-G3BP1, anti-eIF3b et anti-eIF4G. Incuber les anticorps primaires en agitant doucement pendant au moins 1 h à RT ou O/N à 4 °C.
7. Lavez les puits 3 fois avec du PBS et incubez chaque lavage pendant 5 min.
8. Pour les anticorps secondaires, diluer tous les anticorps secondaires (dilution 1/250) et le colorant Hoechst (dilution 1/1 000) dans 5 % de NHS.
   1. Pour cette expérience (12 lamelles à 250 μL chacune-Total : 3 mL de NHS à 5 %), ajoutez 12 μL de chacun des éléments suivants : Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit et Cy5-Goat (une dilution de 1/250 de chaque) et ajoutez 3 μL de colorant Hoechst.
   2. Incuber les lamelles avec les anticorps secondaires pendant 1 h à RT. Au cours de cette étape et des suivantes, protégez les échantillons de la lumière en recouvrant la plaque d’une boîte ou en plaçant une feuille d’aluminium sur le dessus de la boîte de culture tissulaire.
9. Lavez les puits trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
10. Montez les lamelles sur des lames de verre étiquetées à l’aide d’un support de montage. Chauffer le fluide de montage dans un bloc chauffant à 37 °C pendant 10 min ; Cela diminue la viscosité et facilite la pipette. À l’aide d’une pointe P200 coupée, pipeter 25 μL de milieu de montage par lamelle sur une lame de verre ; 4 à 8 lamelles peuvent tenir sur une lame de verre, en supposant que la platine du microscope le permette. À l’aide d’une pince fine, transférez la lamelle du puits à la lame, en veillant à placer le côté cellulaire vers le bas sur le support de montage. À l’aide d’un embout P200 propre, appuyez sur la lamelle.
11. Une fois que toutes les lamelles ont été montées, utilisez du tissu de laboratoire plié pour nettoyer l’excès de support de montage en appuyant très fermement le tissu de laboratoire sur la lame. À l’aide d’un flacon compressible contenant du H₂O, rincez l’excédent de milieu de montage, puis répétez l’application avec un chiffon de laboratoire plié pour éliminer l’eau.

Résultats

Figure 1 : Diagrammes expérimentaux. (A) Ensemencer les cellules sur des lamelles préalablement placées dans une plaque à 24 puits, comme indiqué. Traiter les rangées A et B pendant 60 minutes avec de l’AS ou du VRB en utilisant la concentration en μM indiquée dans la mesure indiquée. Après 60 min, ajouter du CHX (concentration finale : 20 μg/mL pour la colonne 2) ou du puro (...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’exploitation U-2	ATCC	ATCC®HTB-96™	- communément écrit « U2OS" - culture à 37 °C sous 5 % de CO2 dans 10 % de FBS/DMEM
La modification par Dulbecco du médium d'Eagle	Corning	10-013-CV	- abrégé DMEM - contient 4,5 g/L de glucose, de pyruvate et de phénol rouge - complété par 10 % de FBS, 10 mM d’HEPES et de la pénicilline/steptomycine - Préchauffage Dilution du (des) médicament(s) antérieur(s - préchauffage de la dilution du ou des médicaments antérieurs
Sérum fœtal bovin	sigma	F2442-500ml	- abrégé FBS - utilisé pour compléter les milieux
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	Référence 15630-080	- utilisé pour compléter les milieux
Pénicilline Streptomycine	sigma	P0781-100ml	- utilisé pour compléter les milieux
Plaque à 24 puits	Costar	Référence 3524
Tissus de laboratoire	SCIENCE KIMTECH	Référence 34120	- communément appelé « Kimwipes »
Coverglass pour verres de croissance	Fisher Scientific	Tél. : 12-545-82	- autoclavé avant utilisation - Conserver stérile dans le capot de culture tissulaire
(méta)arsénite de sodium ≥90 %	sigma	S7400-100G	- communément appelé arsénite de sodium et abrégé SA - dissolution dans l’eau à une concentration de 1 M, puis dilution à 100 μM sous forme de matière première
Vinorelbine	TSZ CHEM	Réf. RS055	- abrégé VRB - dissoudre dans l’eau à 10 mM
Puromycine	sigma	P9620	- Utilisé pour évaluer le niveau de traduction (ribopuromycylation) - utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active - diluer dans l’eau à 10 mg/mL
Hydrate de dichlorhydrate d’émétine	sigma	E2375	- Utilisé en combinaison avec Puro pour évaluer le niveau général de traduction - utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active - diluer dans l’eau à 10 mg/mL
Cycloheximide	sigma	Réf. C4859	- abrégé CHX - utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active - diluer dans l’eau à 10 mg/mL
Saline tamponnée au phosphate	Lonza / VWR	Référence 95042-486	- abrégé PBS - tampon de lavage pour l’immunofluorescence
Réactif de paraformaldéhyde, cristallin	sigma	P6148-500G	- faire une solution à 4 % dans du PBS chaud dans la hotte, remuer jusqu’à dissolution - les aliquotes peuvent être conservées à - 20 °C pendant plusieurs mois - dangereux, utilisez la ventilation - jeter avec les déchets spéciaux
Méthanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- pré-refroidi à -20°C avant utilisation - jeter avec les déchets spéciaux
Sérum de cheval normal	Thermo Fisher Scientific	Référence 31874	- en abrégé NHS - diluer à 5 % en PBS - ajouter de l’azoture de sodium pour le stockage à 4°C - solution bloquante pour l’immunofluorescence
Éthanol, pur, 200 Proof (100 %),USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	Référence 89125-188	- diluer à 70 % avec de l’eau
Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope	Fisherbrand	Référence 12-550-15
Anticorps anti G3BP1 de souris (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- conserver à 4 °C - Utilisation à une dilution de 1/100
Anticorps anti eIF4G de lapin (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- conserver à 4 °C - Dilution de 1/250
Anticorps anti-eIF3η (N-20) de chèvre	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η est également connu sous le nom de eIF3b - conserver à 4 °C - Dilution de 1/250
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-souris IgG (H+L)	Jackson Immunorecherche	Tél. : 715-225-150	- se reconstituer dans l'eau selon les instructions du fabricant puis conserver à 4°C - Dilution de 1/250
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Lapin IgG (H+L)	Jackson Immunorecherche	Tél. : 711-165-152	- se reconstituer dans l'eau selon les instructions du fabricant puis conserver à 4°C - Dilution 1/2500
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunorecherche	Tél. : 705-175-147	- se reconstituer dans l'eau selon les instructions du fabricant puis conserver à 4°C - Dilution de 1/250
La solution Hoechst 33258	sigma	Référence 94403-1ML	- incuber avec une solution mère d’anticorps secondaires 0,5 mg/mL dans dH20, protéger de la lumière- Conserver à 4 °C
20 x tampon SSC	Thermo pêcheur Ambion	AM9763	- diluer à 2X SSC en utilisant de l’eau libre RNase (traitée au DEPC)- stocker à température ambiante- tampon de lavage pour FISH
Support de montage de glissière	fait maison	/	- mélanger 5 g de poly(alcool vinylique) « soluble à froid » dans 20 ml de PBS- mélanger par sonication, suivi d’un brassage pendant une nuit à RT- Ajouter 5 ml de glycérol et 0,2 ml d’azoture de sodium à 20 %, et agiter pendant 16 h à RT- centrifugation à 20 000 g pendant 20 min, jeter les gros granulés- aliquote liquide visqueux, conservation à long terme à -20°C, 1 semaine à 4°C
Parafilm « M »	sigma	P7793-1EA	- Généralement appelé « parafilm »
Poly(alcool vinylique)	sigma	P-8136-250G	- réactif pour faire du vinol
glycérol	sigma	G5516-100ML	- réactif pour faire du vinol
Azoture de sodium	Fisher Scientific	S2002-5G	- agent de conservation pour solution bloquante et Vinol - faire une dilution de 20 % dans l’eau