Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation du dosage
- Rassembler, préparer et organiser le matériel spécifié pour la procédure (veuillez vous référer au Tableau des matériaux/équipements spécifiques).
- Etiquette 12 tubes de 75 mm.
- Étiquetez deux tubes pour chaque participant : un tube pour le test de phagocytose (étiquetez ce tube avec de l’encre noire et un « F » pour l’isothiocyanate de fluorescéine [FITC]) et un tube pour le test d’activité oxydative en rafale (OB) (étiquetez ce tube avec de l’encre rouge et un « H » pour le dihydroéthidium [HE]).
note: L’utilisation de tubes stériles de 12 x 75 mm est recommandée pour minimiser l’activation cellulaire involontaire et l’augmentation associée du bruit de fond.
- Étiquetez trois tubes pour les contrôles du test : un tube pour le test de phagocytose (contrôle FITC : étiquetez ce tube avec de l’encre noire et un « F »), un tube pour le test d’activité OB (contrôle HE : étiquetez ce tube avec de l’encre rouge et un « H »), et un tube pour le test négatif (Sang uniquement : étiquetez ce tube avec de l’encre verte et « sang uniquement »).
- Préparez les solutions mères au moins un jour avant le jour du dosage.
- Préparez la solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Diluer 100 ml de 10x PBS avec 900 ml de 18,2 MΩ H2O. Stériliser avec un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez le glucose PBS stérile. Dissoudre 1,0 g de glucose dans 100 ml de PBS. Stériliser par filtre avec un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez le tampon stérile de citrate 0,1 M. Dissoudre 1,2 g d’acide citrique et 1,1 g de citrate de sodium dans 100 ml de 18,2 MΩ H2O. Ajuster le pH à 4,0. Stériliser par filtre avec un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez la solution mère d’HE. Mettre à nouveau en suspension 1,0 mg d’HE dans 1,0 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Mélangez délicatement, aliquote et conservez à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez la solution mère de Staphylococcus aureus (S. aureus) marquée au FITC (2 x 109 particules/ml). Mettre en suspension 10 mg de S. aureus marqué FITC dans 1,5 ml (ou une quantité appropriée) de PBS. Diviser en trois aliquotes de 500 μl et sonicate selon les recommandations du fabricant. Aliquote et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez la solution mère de S. aureus non étiquetée (2 x 109 particules/ml). Mettre en suspension 100 mg de S. aureus non étiqueté dans 15 ml (ou une quantité appropriée) de PBS. Diviser en trente aliquotes de 500 μl et sonicate selon les recommandations du fabricant. Aliquote et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez des solutions de travail fraîches le jour de l’essai.
- Préparez la solution fonctionnelle de l’enseignement supérieur. Transférez 10 μl de solution mère d’HE décongelée à 990 μl de PBS-glucose. Protéger de la lumière et garder sur la glace jusqu’à utilisation.
- Préparez la solution de travail de S. aureus marquée FITC (133 333 particules/μl). Transférez 70 μl de solution mère de S. aureus décongelée marquée au FITC à 980 μl de PBS. Protéger de la lumière et garder sur la glace jusqu’à utilisation.
- Préparez la solution de travail non marquée de S. aureus (133 333 particules/μl). Transférez 70 μl de solution mère de S. aureus non marquée, décongelée, à 980 μl de PBS. Protéger de la lumière et garder sur la glace jusqu’à utilisation.
- Préparez la solution de trempe. Ajouter 750 μl de solution de bleu de trypan à 0,4 % à 11,25 ml de tampon stérile de citrate de 0,1 M. Conserver dans un bain d’eau glacée jusqu’à utilisation.
- Demandez à un phlébotomiste certifié de faire une prise de sang conformément aux lignes directrices de l'Organisation mondiale de la santé pour la prise de sang.
- Prélever du sang dans un tube de prélèvement sanguin de 4 ml contenant de l’acide dipotassique éthylènediaminetétraacétique (K2EDTA). Inversez le tube de prélèvement sanguin selon les instructions du fabricant. Conservez le tube de prélèvement sanguin à température ambiante sur une bascule de paillasse jusqu’à utilisation. Utilisez ce sang pour l’analyse de la formule sanguine complète (FSC) avec globules blancs (GB) décrite à l’étape 1.2.1.
- Prélevez du sang dans un tube de prélèvement sanguin de 4 ml contenant de l’héparine de lithium. Inversez le tube de prélèvement sanguin selon les instructions du fabricant. Conservez le tube de prélèvement sanguin à température ambiante (RT) sur une bascule de paillasse jusqu’à utilisation. Utilisez ce sang pour le dosage de la phagocytose des monocytes et des granulocytes et de l’activité OB décrit à l’étape 2.
- Déterminer la quantité de bactéries (c.-à-d. S. aureus) qui sera nécessaire pour effectuer l’analyse de chaque échantillon.
- À l'aide d'un analyseur d'hématologie, effectuer une FSC avec analyse différentielle des globules blancs dans le sang, comme décrit dans les instructions du fabricant. Notez le nombre de globules blancs (en cellules/ml), le pourcentage de neutrophiles et les valeurs de monocytes.
- Utilisez les équations ci-dessous pour déterminer le nombre de neutrophiles et de monocytes pour chaque échantillon.
Numération des neutrophiles (en cellules/ml) = %Neutrophiles × GB (en cellules/ml)
Nombre de monocytes (en cellules/ml) = % de globules blancs × monocytes (en cellules/ml)
- À l’aide des équations ci-dessous, déterminez le nombre de phagocytes pour chaque échantillon et le nombre de phagocytes présents dans 100 μl de l’échantillon.
Numération des phagocytes (en cellules/ml) = Numération des neutrophiles (en cellules/ml) + Numération des monocytes (en cellules/ml)
Nombre de phagocytes dans 100 μl = (nombre de phagocytes (en cellules/ml))/10
- À l’aide de l’équation ci-dessous, déterminez le nombre de bactéries (c.-à-d. S. aureus) nécessaires pour chaque échantillon et la quantité de solution de travail de S. aureus marquée FITC ou de S. aureus non marquée (133 333 particules/ml) qui doit être ajoutée à chaque tube.
note: Le rapport bactéries/phagocytes cibles est de 8:1,
Nombre de bactéries nécessaires = Nombre de phagocytes dans 100 μl × 8
Volume de FITC ou de solution de travail non étiquetée nécessaire (en μl) = (nombre de bactéries nécessaires)/(133 333 particules/μl)
2. Effectuer le dosage
- Préparez le sang total pour le dosage.
- Pour chaque participant et tube témoin, à l’aide d’une pointe de pipette de longueur allongée, transférez 100 μl de sang total du tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium au fond d’un tube de 12 x 75 mm étiqueté de manière appropriée. Remplacez caps.
note: Veillez à ne pas mettre de sang sur les côtés des tubes de 12 x 75 mm.
- À l’aide d’une micropipette, ajoutez 10 μl de solution de travail d’HE dans les tubes étiquetés à l’encre rouge et avec un « H », y compris le tube de contrôle d’HE. Replacez brièvement les capuchons et le vortex.
- Incuber tous les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min. Ensuite, transférez immédiatement tous les tubes dans un bain d’eau glacée pendant 12 min.
note: Utilisez une grille métallique ouverte et secouez doucement la grille toutes les 5 minutes pour vous assurer que les tubes sont rapidement et correctement réchauffés ou refroidis.
- Ajouter des bactéries (c.-à-d. S. aureus) dans les tubes d’échantillon et de contrôle.
- À l’aide d’une micropipette, ajouter la quantité appropriée (calculée à l’étape 1.2.4) de solution de travail de S. aureus non étiquetée dans les tubes étiquetés à l’encre rouge et d’un « H », y compris le tube témoin HE. Replacez brièvement les capuchons et le vortex.
- À l’aide d’une micropipette, ajoutez la quantité appropriée (calculée à l’étape 1.2.4) de la solution de travail de S. aureus étiquetée FITC dans les tubes étiquetés à l’encre noire et d’un « F », y compris le tube de contrôle FITC. Replacez brièvement les capuchons et le vortex.
- Vortex le tube de contrôle « sang seulement », mais n’y ajoutez aucun type de bactérie (c’est-à-dire S. aureus).
- Incuber tous les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. Utilisez une grille métallique ouverte et secouez doucement la grille toutes les 5 minutes pour vous assurer que les tubes sont rapidement et adéquatement réchauffés. Après la période d’incubation, transférez immédiatement tous les tubes dans un bain d’eau glacée pendant 1 min.
- Lavez les cellules.
- À l’aide d’une pipette à répéteur, ajoutez 100 μl de solution de trempe glacée dans tous les tubes. Replacez les bouchons, agitez brièvement, puis incubez tous les tubes sur de la glace pendant 1 min.
- À l’aide d’une pipette à répéteur, ajoutez 1 ml de PBS glacé dans tous les tubes. Vortex brièvement, puis ajoutez 2 ml supplémentaires de PBS glacé à tous les tubes et replacez les bouchons. Centrifuger tous les tubes pendant 5 min à 4 °C et 270 x g, puis aspirer le surnageant.
- Répétez l’étape 2.3.2 une fois (total de 2 lavages).
- Préparer les échantillons pour la cytométrie en flux.
- À l’aide d’une pipette à répéteur, ajoutez 50 μl de sérum fœtal bovin glacé dans tous les tubes. Vortex brièvement tous les tubes.
- Transférez tous les tubes dans un carrousel approprié et utilisez un poste de préparation automatisé de la lyse cellulaire avec des réactifs de lyse des globules rouges (GR) et de fixation des GB pour lyser les globules rouges et fixer les GB comme décrit dans les instructions du fabricant.
