Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Configuration expérimentale
- Utilisez des feuilles de papier filtre (feuilles fibreuses de polyester hydroxylé, voir le tableau des matériaux).
- Bandes découpées de 3 x 15 mm pour un enfant de 1 mois et en forme de L pour les enfants plus âgés et les adultes (5 x 20 x 10 mm (bras court du L)).
- Insérez un morceau de papier filtre dans chaque narine d’un nourrisson à l’aide d’une pince. Placez le papier filtre sur la partie antérieure du cornet inférieur (environ 1 cm à l’intérieur de la narine pour les nouveau-nés et 1,5 cm pour tous les autres âges).
- Placez les nouveau-nés sur un lit et donnez-leur de l’eau sucrée pour plus de confort.
note: Pour les enfants de tous âges, l’échantillonnage s’effectue plus facilement avec le sujet assis sur une chaise.
- Pour les enfants plus âgés, insérez le bras long du papier filtre en forme de L dans chaque narine.
- Appliquez un pince-nez autour des narines pour minimiser l’inconfort et éviter la perte accidentelle du papier filtre.
- Retirez les papiers filtres après 2 min d’absorption.
- Placez les papiers-filtres dans des tubes étiquetés et congelez-les immédiatement à -80 °C.
- Notez tout symptôme d’infection des voies respiratoires présenté par l’enfant le jour du prélèvement.
- Notez tout éternuement, pleurs persistants ou épistaxis qui se produit pendant les 2 minutes d’échantillonnage.
2. Quantification des médiateurs immunitaires des voies respiratoires
- Prélevez jusqu’à 10 échantillons aléatoires du congélateur. Notez les numéros d’identification. Gardez les échantillons sur de la glace pendant tout le processus de travail.
- Après la décongélation sur de la glace, immerger les papiers-filtres (par sujet) des deux narines dans 300 μL de tampon fraîchement préparé (voir le tableau des matériaux) contenant un comprimé complet d’inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux) par 25 ml de tampon.
- Ajustez le volume de la mémoire tampon en fonction de la taille du papier filtre.
- Utilisez 300 μL de tampon pour les papiers filtres de 3 x 15 mm.
- Si vous ne disposez que d’un seul papier filtre, utilisez la moitié du volume de la mémoire tampon (150 μL).
- Transférez les échantillons dans un agitateur à plaques (400 tr/min) pendant 5 min. Utilisez une minuterie.
- Transférez les papiers filtres humides et le tampon de dosage dans la coupelle d’un tube filtrant en acétate de cellulose (pores de 0,22 μm) placé dans un tube de microcentrifugation (voir le tableau des matériaux).
- Centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse refroidie (à 4 °C) pour obtenir un extrait nasal filtré dans le tube.
- Retirez la tasse et maintenez les tubes sur de la glace tout en aliquotent l’extrait nasal dans les puits des plaques de stockage à faible teneur en protéines (voir le tableau des matériaux).
- Conserver à -80 °C jusqu’à l’analyse.
- Déterminer les concentrations de cytokines et de chimiokines dans les extraits nasaux à l’aide d’un système de réseau multiplexé à haute sensibilité basé sur l’électrochimiluminescence (voir le tableau des matériaux).
L : Un test de cytokines humaines 10-plex TH1/TH2, un test de chimiokine 9-plex et d’interleukine-17A (IL-17A), de facteur de croissance transformant-bêta1 (TGF-β1) et de lymphopoïétine stromale thymique (TSLP) ont été réalisés ici.
- Pour les dosages, incuber les extraits nasaux pendant la nuit à 4 °C. Effectuer les mesures conformément au protocole standard du fabricant (voir le tableau des matériaux).
note: Les immunoessais (voir le tableau des matériaux) ont généralement une plage dynamique élevée pour des mesures allant de 1 à 10 000 pg/mL, mais pour certains tests, elle peut être de 100 000 pg/mL. Cela signifie que tous les échantillons peuvent être analysés à la même dilution, limitant ainsi l’influence de dilutions dissemblables chez les sujets sains et malades, comme c’est le cas dans d’autres immunoessais similaires. La limite inférieure de détection pour toutes les cytokines était de 1 pg/mL ou moins, et pour les chimiokines, elle variait entre 1 et 50 pg/mL. La TSLP n’était pas détectable dans 98 % des échantillons à l’âge de 1 mois.
