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1. Conception et préparation des peptides
- Acquérir la séquence de la protéine de fusion d’intérêt à partir d’une base de données publique telle que NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou la base de données des pathogènes du virus (https://www.viprbrc.org). Choisissez le site de reconnaissance de la protéase précédant le peptide de fusion et incluez 2-3 acides aminés en amont et en aval de cette séquence.
- Lors de la commande des peptides, modifiez-les avec la paire FRET 7-méthoxycoumarine-4-yl acétyle (MCA) à l’extrémité N-terminale et N-2,4-dinitrophényle (DNP) à l’extrémité C-terminale.
note: Plusieurs fournisseurs proposent ces modifications. Le prix et le délai de livraison dépendent du fournisseur choisi. Cependant, il existe d’autres modifications qui varient en sensibilité et nécessitent des ajustements du lecteur de plaques en termes de longueurs d’onde.
- Remettez le peptide en suspension selon les recommandations du fabricant en le pipetant doucement de haut en bas. Par exemple, remettre en suspension des peptides dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à la concentration finale de 1 mM.
- En option, ajoutez le tube contenant le peptide et le solvant dans un bain de sonication jusqu’à ce qu’il soit complètement remis en suspension si le peptide ne se remet pas très bien en suspension par pipetage.
- Aliquote le peptide dans des tubes résistants à la lumière ou à la lumière pour protéger le peptide du blanchiment. Veillez à ce que les aliquotes soient petites pour éviter plusieurs cycles de congélation ou de décongélation (p. ex., 100 μL). Stocker les aliquotes à -20° C.
2. Préparation du lecteur de plaques de fluorescence
- Allumez le lecteur de plaques et attendez la fin de l’autotest.
- Ouvrez le logiciel d’exploitation sur l’ordinateur connecté et assurez-vous qu’il est connecté au lecteur de plaques.
- Ouvrez le réglage de température et réglez-le sur 30 °C (ou la température requise pour des performances optimales pour la protéose).
- Cliquez sur Contrôle | Configuration de l’instrument pour mettre en place l’expérience.
- Choisissez Cinétique.
- Sélectionnez Fluorescence.
- Entrez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission : 330 nm et 390 nm respectivement.
- Désélectionnez Coupure automatique.
- Sélectionnez Moyenne, sensibilité normale.
- Choisissez une durée de fonctionnement de 1 h pour le test et sélectionnez une mesure toutes les 60 s.
- Réglez 5 s de mélange avant la première mesure et 3 secondes avant chaque mesure
- Sélectionnez les puits à lire et commencez l’analyse.
3. Préparation du test
- Préparez le tampon d’essai en calculant les quantités appropriées pour chaque ingrédient et en l’ajoutant. Pour la furine, préparez un tampon composé de 100 mM d’HEPES, 1 mM de CaCl2, 1 mM de 2-mercaptoéthanol et 5 % de Triton X-100. Pour la trypsine, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
note: Des volumes de 10 ml ou moins sont suffisants. Selon la ou les protéases utilisées dans le dosage, le tampon varie.
- Réfrigérez le tampon sur de la glace.
- Placez la plaque de dosage sur de la glace avec une fine plaque métallique en dessous pour favoriser le refroidissement et la stabilité. Utilisez une plaque de polystyrène noir solide à 96 puits à fond plat et non traitée.
note: Il est essentiel d’utiliser des plaques noires pour éviter les « fuites » fluorescentes des puits adjacents.
- Calculez la quantité appropriée de protéase à ajouter pour chaque réaction en fonction des publications précédentes ou des données expérimentales. Pour la furine, utiliser 1 unité par réaction qui correspond à 0,5 μL. Pour la trypsine, utilisez 0,5 μL de trypsine TPCK 160 nM.
- Par échantillon, préparer 3 répétitions techniques par essai dans un volume total de 100 μL par échantillon.
note: Il a été évalué expérimentalement qu’il n’y a pas de différence que le pipetage soit effectué dans des conditions de lumière normales ou à une lumière tamisée. Cependant, les peptides ne doivent pas être exposés à la lumière pendant une période prolongée.
- Pipeter la quantité appropriée de tampon de dosage (94,5 μL comme décrit à l’étape 3.1) dans chaque puits.
- Ajouter la protéase dans chaque puits. Pour la furine et la trypsine TPCK, utilisez 0,5 μL par échantillon. À 6 puits (3 puits pour un témoin à blanc et 3 puits pour un contrôle peptidique), ajoutez 0,5 μL de tampon au lieu de la protéase respective.
- Ajouter le peptide à une concentration finale de 50 μM dans chaque puits, à l’exception du témoin à blanc. Dans ce cas, la pipette peptide de 5 μL a été préparée comme décrit à l’étape 1.3. Ajoutez 5 μL de tampon au contrôle blanc au lieu de peptide.
note: Plusieurs concentrations du peptide ont d’abord été testées avec les concentrations enzymatiques décrites pour s’assurer que les enzymes étaient saturées.
- Insérez la plaque dans le lecteur de plaques de fluorescence et cliquez sur Démarrer.