Un test de clivage peptidique fluorogénique pour cribler l’activité protéolytique des protéases

Abstract

Source : Jaimes, J. A., et al. A Fluorogenic Peptide Cliavage Assay to Screen for Proteolytic Activity : Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente un test permettant de dépister l’activité protéolytique des protéases à l’aide de peptides fluorogènes. La protéase reconnaît son site de clivage sur le peptide, le clivant et séparant le quencher du fluorophore, permettant ainsi son émission de fluorescence. Le signal de fluorescence est détecté et analysé pour vérifier l’efficacité du clivage des différentes variantes peptidiques.

Protocol

1. Conception et préparation des peptides

1. Acquérir la séquence de la protéine de fusion d’intérêt à partir d’une base de données publique telle que NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou la base de données des pathogènes du virus (https://www.viprbrc.org). Choisissez le site de reconnaissance de la protéase précédant le peptide de fusion et incluez 2-3 acides aminés en amont et en aval de cette séquence.
2. Lors de la commande des peptides, modifiez-les avec la paire FRET 7-méthoxycoumarine-4-yl acétyle (MCA) à l’extrémité N-terminale et N-2,4-dinitrophényle (DNP) à l’extrémité C-terminale.
   note: Plusieurs f....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptides	Biomatik	n/a
Furine	Oné	P8077S
Trypsine traitée TPCK	Sigma-Aldrich	Réf. 4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	Réf. C1016
2-Mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M6250
Triton-X100	Sigma-Aldrich	X100
Pbs	Corning	Référence 21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Dispositifs moléculaires	XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Dispositifs moléculaires	n/a
Plaque à 96 puits (polystyrène noir solide à fond plat et non traitée)	Costar	Référence 3915
Tubes d’amortissement légers	Laboratoire Watson	131-915BL ou 131-915BR