Suivi de l’arrivée de protéines de surface marquées à la GFP dans le réseau trans-Golgi à l’aide de nanocorps fonctionnalisés

Résumé

Source : Buser, D. P., et al. Analyse de l’absorption endocytaire et du transport rétrograde vers le réseau trans-Golgi à l’aide de nanocorps fonctionnalisés dans des cellules cultivées. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode pour étudier l’absorption et le transport rétrograde de nanocorps fonctionnalisés afin de comprendre leurs voies de trafic intracellulaire. En introduisant du sulfate radiomarqué et en utilisant des techniques d’isolement et de détection, cette méthode permet d’étudier l’absorption endocytaire et l’arrivée des protéines cargo par le réseau trans-Golgi.

Protocole

1. Absorption de nanocorps fonctionnalisés par des cellules cultivées (pour l’analyse de sulfatation)

1. Dans une hotte de culture cellulaire, ensemencez ~400 000 à 500 000 cellules HeLa exprimant de manière stable une protéine rapporteure marquée à la GFP dans des boîtes de 35 mm ou sur des amas à 6 puits avec un milieu complet contenant des antibiotiques (milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF), 100 unités/ml de streptomycine, 2 mM de l-glutamine et 1,5 μg/mL de puromycine).
   note: Comme mentionné ci-dessus, nous utilisons ici des cellules HeLa exprimant de manière stable EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR et TfR-EGFP à des fins d’illustration. Outre les lignées cellulaires stables, il est également possible d’utiliser HeLa transfecté transitoirement.
2. Incuber les cellules O/N à 37 °C dans un incubateur à 7,5 % de CO₂ pour proliférer.
   note: Les cellules devraient avoir une confluence de ~80 % le lendemain.
3. Retirez le milieu complet, lavez-le 2 fois avec 1 PBS à RT et affamez les cellules avec un milieu sans sulfate (SFM) pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à 7,5 % de CO₂.
   note: Le SFM est préparé en ajoutant 10 mL de solution d'acides aminés MEM (50x), 5 mL de L-glutamine (200 mM), 5 mL de solution vitaminique (100x) et 900 μL de CaCl₂·2H₂O à 500 mL de sels équilibrés d'Eagle. Passer à travers un filtre de 0,22 μm et aliquote.
4. Dans une hotte ventilée ou un banc conçu pour les travaux sur la radioactivité, préparer un milieu de marquage au sulfate contenant 0,5 mCi/mL [³⁵S] de sulfate sous forme de sel de sodium dans SFM.
   prudence: Manipulez avec précaution toutes les solutions contenant de la radioactivité. Ne travaillez que dans des hottes ou des bancs désignés. Tous les matériaux (pointes, tubes, plaques, etc.) ou les tampons de lavage en contact avec la radioactivité doivent être collectés et éliminés séparément. Faites-le également pour toutes les étapes ci-dessous (étapes 1.5 à 1.18).
5. Ajouter le VHH-2xTS dans 1x PBS dans le milieu de marquage du sulfate jusqu’à une concentration finale de 2 μg/mL.
   note: En tant que contrôle, incluez également VHH-std ou un autre nanocorps dépourvu de sites TS pour démontrer un marquage spécifique.
6. Remplacer le SFM par 0,7 mL de milieu de marquage au sulfate contenant 0,5 mCi/mL de sulfate de [35S] et 2 μg/mL de VHH-2xTS et incuber les cellules pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur à 7,5 % de CO₂ conçu pour le travail avec radioactivité.
   note: En fonction de l’expérience prévue, le temps de sulfatation des nanocorps doit être ajusté. De plus, pour déterminer la cinétique d’arrivée du TGN, l’étiquetage est effectué pour différents temps (par exemple, pendant 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
7. Retirez le support d’étiquetage et lavez les cellules 2 à 3 fois avec du 1x PBS glacé sur une plaque de refroidissement ou de la glace.
8. Ajouter 1 mL de tampon de lyse (PBS contenant 1 % de Triton X-100 et 0,5 % de désoxycholate) complété par 2 mM de PMSF et 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et incuber les cellules pendant 10 à 15 min sur une plate-forme à bascule à 4 °C.
9. Grattez et transférez le lysat dans un tube de 1,5 mL, agitez le lysat et placez-le pendant 10 à 15 minutes sur un rotateur d’un bout à l’autre à 4 °C.
10. Préparer un lysat postnucléaire par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
11. À l’aide d’un tube neuf de 1,5 ml, préparez 20 à 30 μL d’une boue de billes de nickel dans un tube de 1,5 ml et lavez-les une fois avec 1 x PBS en les granulant doucement à 1 000 x g pendant 1 min
    note: Au lieu de billes de nickel, des billes de streptavidine (si le nanocorps est biotinylé) ou des billes de protéine A avec une IgG contre un épitope du nanocorps (T7- ou HA-tag) peuvent être utilisées.
12. Transférez le lysat postnucléaire dans un tube de 1,5 mL contenant des billes de nickel et incubez pendant 1 h à 4 °C sur un rotateur bout à bout pour isoler les nanocorps. Prélever une aliquote (50-100 μL) du lysat postnucléaire et faire bouillir dans un tampon d’échantillon SDS pour une analyse ultérieure par immunotransfert du nanocorps associé à la cellule totale, du rapporteur GFP et du contrôle de la charge.
13. Lavez les billes 3 fois avec 1x PBS ou tampon de lyse en granulant doucement à 1 000 x g pendant 1 min.
    note: Pour un lavage plus rigoureux des billes, 20 mM d’imidazole peuvent être inclus dans du PBS ou un tampon de lyse.
14. Retirez soigneusement tout le tampon de lavage des billes, ajoutez 50 μL de tampon d’échantillon 2x et faites bouillir pendant 5 min à 95 °C.
15. Chargez les deux billes bouillies sur un gel midi 12,5 % SDS-PAGE et faites-les fonctionner selon le protocole PAGE standard jusqu’à ce que le colorant de référence (par exemple, le bleu de bromophénol) ait atteint la fin du gel de séparation.
    note: L’analyse immunoblot du nanocorps associé à la cellule totale, du rapporteur GFP et du contrôle de charge peut également être effectuée à l’aide d’un mini SDS-PAGE à 12,5 % ou d’un gel à gradient préfabriqué.
16. Fixez le gel séparateur dans ~30 mL de tampon de fixation (10 % d’acide acétique et 45 % de méthanol dans ddH₂O) pendant 1 h à RT, lavez le gel trois fois avec ~50 mL d’eau déminéralisée et préparez-vous pour le séchage sur gel.
17. Séchage des gels SDS-PAGE.​
    1. Placez soigneusement le gel fixé sur un film alimentaire étiré et couvrez-le de papier filtre prédécoupé.
    2. Placez le gel avec le papier filtre sur le dessus de la plate-forme de séchage, placez le couvercle de l’aspirateur et allumez la pompe à vide pour le séchage du gel. Séchez le gel pendant 3 à 5 heures.
    3. Retirez le film alimentaire et placez le gel séché dans une cassette d’autoradiographie équipée d’un écran au phosphore.
18. Autoradiographie d’image à l’aide d’un imageur à écran au phosphore. Suivez les instructions du fabricant.
    note: En fonction de la force du signal, les gels séchés doivent être exposés plus longtemps avec des écrans au phosphore.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-GFP	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	Le produit est distribué par SigmaAldrich, mais fabriqué par Roche
Milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich
Sérum de veau fœtal (SCF)	Biowest
Soufre-35 sous forme de sulfate de sodium	Hartmann Analytique	ARS0105	Le produit contient 5 mCi
Plaques à 6 puits	Le	Référence 92406
Paraformaldéhyde (PFA)	Applichem	A3813
Fluoromount-G	Biotech du Sud	Référence 0100-01
Gels Mini-Protean TGX, 4-20 %, 15 puits	Bio-Rad	Tél. : 456-1096