Un test pour quantifier la phagocytose médiée par des anticorps d’érythrocytes infectés par des parasites

Résumé

Source : Quintana, M. d. P. et al., Mesure des anticorps induisant la phagocytose acquis naturellement contre les parasites de Plasmodium falciparum par un test basé sur la cytométrie en flux.J. Vis. Exp.(2020)

Cette vidéo présente un test de phagocytose basé sur la cytométrie en flux impliquant des érythrocytes marqués et opsonisés infectés par Plasmodium falciparum par des monocytes. La cytométrie en flux identifie la fluorescence dans les monocytes, confirmant ainsi l’identification réussie des érythrocytes opsonisés par phagocytose.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Culture parasitaire

REMARQUE : Respectez les réglementations locales pour la manipulation des agents pathogènes humains.

1. Maintenir les parasites de Plasmodium falciparum conformément au protocole standard décrit précédemment dans le milieu de culture de parasites (voir le tableau des matériaux).
2. Gardez les parasites étroitement synchronisés en utilisant le traitement au sorbitol comme décrit précédemment.
3. Pour assurer l’expression VAR2CSA à la surface des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE), effectuez des cycles répétés de sélection magnétique immunitaire à l’aide d’un anticorps anti-VAR2CSA (par exemple, un anticorps PAM1.4, une IgG monoclonale humaine VAR2CSA spécifique à réaction croisée) couplé à des billes magnétiques de protéine G.
   1. En bref, incubez des trophozoïtes-IE à un stade avancé avec des billes magnétiques couplées à un anticorps anti-VAR2CSA et sélectionnez-les positivement à l’aide d’un aimant.
   2. Développez les parasites sélectionnés en culture pendant quelques cycles jusqu’à ce que la parasitémie soit d’au moins 5 %.
   3. Vous pouvez également sélectionner des parasites qui se lient à l’ASC immobilisé par le plastique (le récepteur de l’VAR2CSA), comme décrit précédemment.
4. Pour vérifier VAR2CSA’expression sur les parasites sélectionnés, effectuez la cytométrie en flux comme décrit précédemment.
   1. En bref, marquez les trophozoïtes-IE de stade avancé avec le même anticorps que celui utilisé pour la sélection magnétique (étape 1.3) suivi d’un anticorps secondaire marqué par fluorescence.
   2. Mesurez la réactivité de surface de l’IE par cytométrie en flux. Une sélection réussie des anticorps aboutit normalement à une population de parasites qui exprime VAR2CSA chez la plupart des parasites (≈80
    %).
5. Pour le dosage de la phagocytose, utiliser des trophozoïtes-IE purifiés de stade intermédiaire à avancé. Effectuez la purification à l’aide de la séparation magnétique comme décrit précédemment.
   note: Pour déterminer avec précision le stade des parasites, effectuez une coloration Giemsa sur des frottis sanguins suivie d’une observation en microscopie optique. Suivez les procédures standard et les directives morphologiques décrites précédemment. La purification à un stade avancé peut également être effectuée à l’aide d’un milieu à gradient de densité. Le rendement IE, cependant, dans notre expérience, est plus faible, et, par conséquent, la purification magnétique est préférable.
   1. Pour la séparation magnétique, faites tourner la culture de parasites (5-10 % de parasitémie) à 500 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de culture de parasites.
   2. Ajoutez la suspension parasitaire dans une colonne de silice Claricep Flash, couplée à un aimant (voir tableau des matériaux) et laissez-la passer lentement à travers la colonne. Les trophozoïtes-IE sont paramagnétiques (en raison de la présence d’hémozoïne) et resteront dans le maillage de la colonne.
   3. Laver la colonne avec 50 mL de milieu de culture de parasites et éluer les IE de la colonne magnétique à l’aide de 50 mL de milieu de culture de parasites.
6. Faites tourner l’éluat de 1.5.3 à 500 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter soigneusement le surnageant et le remettre en suspension dans 1 mL de milieu de culture de parasites.
7. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre d’EI (facilement identifiables par la microscopie optique comme des érythrocytes avec un pigment d’hémozoïne foncé) et le nombre total de cellules pour calculer la parasitémie finale (pourcentage d’EI).
   note: N’utilisez que des parasites d’une pureté d’au moins 80 % (80 % d’IE).
8. En fonction du nombre d’échantillons de sérum/anticorps prévus pour les tests, estimez la quantité totale d’EI nécessaire et augmentez les cultures de parasites en conséquence. Une fiole de^{culture de 2} cm contenant 25 mL de culture à 5 % d’hématocrite et 5 à 10 % de parasitémie devrait produire suffisamment d’IE pour faire fonctionner une plaque complète de 96 puits. Pour une plaque complète (42 échantillons plus 6 témoins en double), un minimum de 1,5 mL de suspension parasitaire à 3,3 x 10⁷ IE/mL est nécessaire.

2. Cellules THP-1

REMARQUE : La lignée cellulaire THP-1 est utilisée dans ce test. Cette lignée cellulaire monocytaire est dérivée d’un patient atteint de leucémie monocytaire et peut être achetée auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC). Maintenir la lignée cellulaire selon les instructions du fournisseur dans le milieu de culture THP-1 (voir la table des matériaux).

1. Pour un entretien régulier, commencer la culture cellulaire de THP-1 à 2-4 x 10⁵ cellules/mL et la sous-culture lorsque la concentration cellulaire atteint 8 x 10⁵ cellules/mL.
   note: Ne laissez pas la concentration cellulaire dépasser 1 x 10⁶ cellules/mL et gardez une trace du nombre de passages. Évitez d’utiliser des cellules qui sont au-delà du passage 25. Le temps moyen de doublement de la lignée cellulaire THP-1 varie entre 19 et 50 h. Déterminer le temps de doublement du lot cellulaire avant de commencer les expériences de phagocytose. Cela aidera à estimer approximativement la quantité de culture nécessaire pour un nombre déterminé d’échantillons de sérum à analyser (p. ex., pour une plaque complète de 96 puits, 10 mL de culture à 5 x 10 5 cellules/mL sont nécessaires).
2. Vérifiez périodiquement les cellules THP-1 pour l’expression de surface des récepteurs Fcγ I (CD64), II (CD32) et III (CD16) comme décrit précédemment.
   1. En bref, colorez les cellules THP-1 (séparément) avec des anticorps anti-CD64, anti-CD32 et anti-CD16 marqués par fluorescence (Table des matériaux) pendant 30 min à température ambiante (dilution 1:100 préparée dans du sérum de bovin fœtal à 2 % (FBS) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Laver trois fois avec 2 % de FBS dans du PBS et mesurer la coloration de surface par cytométrie en flux.
      note: Les cellules THP-1 sont négatives pour CD16 et positives pour CD32 et CD64, comme indiqué précédemment (figure 1).
3. Pour le test de phagocytose, installez un flacon de culture cellulaire THP-1 avec 2,5 x 10⁵ cellules/mL la veille de l’expérience pour obtenir environ 5 x 10⁵ cellules/mL le jour du test.
   note: S’assurer que 4 à 6 x 10⁵ cellules/ml sont présentes le jour du dosage.

3. Test de phagocytose (Figure 2)

1. Avant de commencer le test, bloquer (>1 h) deux plaques à fond rond à 96 puits (une pour l’opsonisation et une autre pour la phagocytose) en utilisant 150 μL par puits de FBS stérile à 2 % dans du PBS.
   note: Étiquetez la plaque 1 comme plaque d’opsonisation et utilisez-la à la fois pour la coloration au bromure d’éthidium (EtBr) et l’opsonisation. Étiquetez la plaque 2 comme plaque de phagocytose et utilisez-la à la fois pour le placage des cellules THP-1 et pour l’étape de phagocytose.
2. Coloration et opsonisation des parasites
   1. Prendre la suspension d’IE préparée à 1,6 et ajuster la numération cellulaire à 3,3 x 10⁷ IEs/mL en ajoutant du milieu de culture parasitaire et du bromure d’éthidium (EtBr) pour obtenir une concentration finale de 2,5 μg/mL (dilution 1:40, à partir d’un stock de 0,1 mg/mL).
      note: L’EtBr colore l’ADN du parasite, ce qui permet la détection par cytométrie en flux.
      prudence: L’EtBr est un mutagène et un irritant pour la peau, les yeux et les voies respiratoires. Utilisez une protection appropriée et éliminez les déchets conformément aux réglementations locales.
   2. Retirez la solution de blocage de l’une des plaques à 96 puits (plaque d’opsonisation), en retournant la plaque et en enlevant l’excès de liquide sur un morceau de papier essuie-tout.
   3. Ajouter 30 μL par puits de la suspension IE préparée ci-dessus dans la moitié supérieure de la plaque. Laisser un puits vide et ajouter 30 μL de milieu de culture parasitaire (sans IE pour le contrôle THP-1 seul). (Figure 3A). Incuber 10 min à température ambiante et à l’abri de la lumière.
   4. Ajouter 170 μL par puits de milieu de culture de parasites. Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante et retirez le surnageant en agitant la plaque sur un récipient à déchets approprié.
   5. Lavez les IE marqués à l’EtBr deux fois de plus en utilisant 200 μL par puits de milieu de culture de parasites en faisant tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante. Le surnageant du premier lavage peut être retiré en retournant la plaque. Retirez soigneusement le surnageant du deuxième lavage à l’aide d’une pipette multicanaux pour vous assurer que tout le volume du produit de lavage est éliminé. Ne dérangez pas le granulé.
   6. Remettre en suspension les IE marqués à l’EtBr dans 30 μL de solution d’anticorps/plasma/sérum préparée aux concentrations souhaitées dans un milieu de culture de parasites.
   7. Incluez toujours les témoins suivants (figure 3B) : un témoin sans contrôle des cellules IE/THP-1 (milieu de culture du parasite) ; un témoin sans anticorps ni plasma/sérum (témoin non opsonisé) ; un témoin positif utilisant l’anticorps anti-érythrocytes humains de lapin disponible dans le commerce à une dilution de 1:100 (voir le tableau des matériaux); deux témoins plasma/sérum négatifs à une dilution de 1:5 (un pool naïf de paludisme et un pool de mâles exposés au paludisme) ; et un contrôle sérique positif à une dilution de 1:5 (un pool de femmes exposées au paludisme, qui ont déjà été enceintes (de préférence des multigravidae)).
      note: Une dilution de 1:100 pour le témoin positif semble fonctionner de manière cohérente entre différents lots d’anticorps achetés (données non présentées). Cependant, il est recommandé d’exclure les variations entre les lots en testant plusieurs dilutions à chaque fois qu’un nouveau lot d’anticorps est utilisé.
   8. Incuber pendant 45 min dans l’obscurité à 37 °C.
3. Préparation et phagocytose des cellules THP-1
   1. Pendant que les IE sont opsonisés (3.2.8), commencer à préparer les cellules THP-1.
   2. Retirez les cellules de THP-1 de la fiole de culture, faites-les tourner (500 x g pendant 5 min à température ambiante), décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le milieu de culture de cellules de THP-1.
   3. Essorez à nouveau (500 x g pendant 5 min à température ambiante), décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de culture cellulaire THP-1.
   4. Déterminer le nombre de cellules dans la solution préparée ci-dessus et ajouter plus de milieu pour obtenir une concentration finale de 5 x 10⁵ cellules/mL.
   5. Retirez la solution bloquante de la plaque restante à 96 puits (plaque de phagocytose) en retournant la plaque et en enlevant l’excès de liquide sur un morceau de papier essuie-tout.
   6. Ajouter 100 μL par puits de la suspension cellulaire de THP-1 préparée en 3.3.4 et la remettre dans l’incubateur de culture cellulaire (figure 3C).
   7. Une fois le temps d’incubation de l’anticorps/plasma/sérum terminé, ajoutez 170 μL par puits de milieu de culture du parasite. Faites tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante et retirez le surnageant en agitant la plaque sur un récipient à déchets approprié.
   8. Lavez les IE opsonisés deux fois de plus en utilisant 200 μL par puits de milieu de culture de parasites, en faisant tourner la plaque à 500 x g pendant 3 min à température ambiante. Le surnageant du premier lavage peut être retiré en retournant la plaque. Retirez délicatement le surnageant du deuxième lavage, à l’aide d’une pipette multicanaux pour vous assurer que tout le volume de produit de lavage est éliminé. Ne dérangez pas le granulé.
   9. Enfin, remettre en suspension les IE opsonisés dans 100 μL de milieu de culture cellulaire THP-1 préchauffé. Transférer 50 μL de suspension d’IE opsonisée dans chaque puits de la plaque de phagocytose. Comme il y a un total de 100 μL d’IE, chaque dilution anticorps/sérum peut être exécutée en deux exemplaires dans la plaque de phagocytose (Figure 3D)
      note: La quantité de cellules IE et THP-1 utilisées dans le test correspond à un rapport de 10:1.
   10. Incuber pendant 40 min dans l’obscurité à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
       note: Ne laissez pas la phagocytose se poursuivre pendant plus de 40 minutes.
   11. Arrêter la phagocytose par centrifugation à 4 °C (500 x g, 5 min) et jeter le surnageant en retournant la plaque. Ajouter 150 μL de solution de lyse de chlorure d’ammonium à température ambiante (Tableau des matériaux) et mélanger par pipetage, incuber pendant exactement 3 min.
       note: Cette étape va lyser les érythrocytes qui n’ont pas été phagocytés par les cellules THP-1.
   12. Arrêtez la lyse en ajoutant 100 μL de FBS 2 % glacé dans du PBS. Faites tourner la plaque à 4 °C (500 x g pendant 3 min) et retirez le surnageant en faisant pivoter la plaque sur un conteneur à déchets approprié.
   13. Laver trois fois avec 200 μL par puits de FBS 2 % glacé dans du PBS en tournant la plaque à 4°C (500 x g pendant 3 min). Après le lavage final, remettre en suspension dans 200 μL de FBS 2 % glacé dans du PBS et immédiatement analyser par cytométrie en flux.
       note: Des publications antérieures ont utilisé la fixation cellulaire dans du paraformaldéhyde à 2 % avant la cytométrie en flux³¹, mais les résultats présentés ici ont été obtenus immédiatement après la fin du test. Il n’est pas recommandé de retarder l’acquisition des données de cytométrie en flux en stockant la plaque à 4 °C, car le pourcentage de cellules EtBr⁺ THP-1 diminue rapidement (Figure 4).

4. Acquisition et analyse de la cytométrie en flux

REMARQUE : Tout cytomètre en flux prenant en charge le format de plaque à 96 puits et disposant des lasers/filtres appropriés pour mesurer la fluorescence de l’EtBr peut être utilisé.

1. Pour l’acquisition, effectuez une porte sur les cellules THP-1 à l’aide d’un tracé de diffusion directe linéaire (FSC) par rapport à une diffusion latérale linéaire (SSC) en utilisant les puits où aucun IE n’a été ajouté (Figure 2A) et acquérez 10 000 événements sur cette porte.
2. Mesurez l’intensité de fluorescence d’EtBr (FL3-Log) sur la porte THP-1 à l’aide d’un graphique d’histogramme.
3. Pour le gating, première porte sur les cellules THP-1 dans un graphique de densité FSC vs. SSC, en utilisant les puits où aucun EI n’a été ajouté (Figure 5A). Ensuite, mettez en place une porte positive dans un histogramme FL3 (EtBr), en utilisant les cellules THP-1 (aucun IE ajouté) et le contrôle non opsonisé (Figure 5B).
4. Copiez ces portes dans tous les autres échantillons testés dans la même plaque et déterminez le pourcentage de cellules THP-1 EtBr-positives (cellules THP-1 qui ont phagocytisé au moins un IE). Pour chacun des échantillons testés, la phagocytose peut être rapportée sous forme de valeurs absolues (pourcentage de cellules EtBr⁺ THP-1) ou de phagocytose relative calculée comme le pourcentage utilisant le contrôle positif au maximum.

Résultats

Figure 1 : Récepteurs Fc exprimés à la surface de la cellule THP-1. (A) Récepteur Fcγ III/CD16 (rouge). (B) Récepteur Fcγ II/CD32 (vert). C. Récepteur Fcγ I/CD64 (orange). Les cellules non étiquetées sont affichées en bleu.

Figure 2 : Organigramme...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture cellulaire à 96 puits, fond rond avec couvercle	Corning	Référence 3799	N’importe quelle plaque similaire peut être utilisée, assurez-vous qu’elle est compatible avec l’instrument de cytomètre en flux que vous avez l’intention d’utiliser
AlbuMAX-II	Gibco	Référence 11021-037
AlbuMAX-II (5 %)	-	-	5 % AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0,2 g/L d’hypoxanthine (Sigma, H9377) dans RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anticorps anti-globules rouges	Abcam	AB34858	Préparez des aliquotes et congelez-les à -20°C. Utilisez une aliquote par expérience.
Le	sigma	Réf. P8622
Dynabeads Protéine G	Invitrogen	10003D
Solution de bromure d’éthidium	sigma	E1510	Préparer une solution mère à 0,1 mg/mL dans RPMI1640 (R5886). Stocker à l’abri de la lumière
Cytomètre en flux FC500	Beckman Coulter		Tout cytomètre en flux prenant en charge le format de plaque à 96 puits et disposant des lasers/filtres appropriés pour mesurer la fluorescence de l’EtBr peut être utilisé.
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	Référence 10099-141	Inactiver la chaleur avant utilisation.
FITC souris anti-humain CD16	BD Biosciences	555406 ou 556618
FITC souris anti-humaine CD32	BD Biosciences	552883
FITC souris anti-humain CD64	BD Biosciences	555527
Logiciel FlowLogic	Les technologies Inivai		N’importe quelle analyse de cytométrie en flux peut être utilisée, par exemple FlowJo ou Winlist
Gentamicine (10 mg/mL)	sigma	G1272
hypoxanthine	sigma	N° H9377
L-glutamine (200mM)	sigma	Référence G7513
Solution de lyse	-	-	15 mM NH4Cl, 10 mM NaHCO3, 1 mM EDTA
Colonne MACS CS et accessoires	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-041-305
Milieu de culture parasitaire	-	-	2 mM de L-glutamine (Sigma, G7513), 50 μg/mL de gentamicine (Sigma, G1272), 0,5 % d’AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5 %) dans RPMI1640 (Sigma, R5886)
Pénicilline/streptomycine (10000U et 10mg/mL)	sigma	Réf. P0781
RPMI-1640 moyen	sigma	Réf. R5886
Milieu de culture THP-1	-	-	10 % FBS (Gibco, 10099-141), 2 mM de L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL de pénicilline, 0,1 mg/mL de streptomycine (Sigma, P0781) dans RPMI1640 (Sigma, R5886)
Aimant Vario MACS	Miltenyi Biotec