REMARQUE : Les protocoles suivants décrivent la préparation de l’échantillon et la quantification de l’activité des protéases à sérine neutrophiles (NSP). Les procédures expérimentales présentées ici se concentrent sur la mesure de l’activité de l’élastase (NE) ou de la cathepsine G (CG) humaine dans les expectorations. Cependant, de légères adaptations dans le protocole de préparation des échantillons rendent possible l’analyse des cellules dérivées du sang et des homogénats tumoraux. De plus, les activités de la métalloprotéinase matricielle et de la cathepsine S peuvent être étudiées de manière similaire au moyen de sondes FRET dédiées
1. Préparation des échantillons : isolement cellulaire et séparation du surnageant
REMARQUE : Si possible, le traitement des expectorations doit être effectué dans les 120 minutes suivant l’expectoration et les expectorations doivent être stockées sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient traitées.
- Si l’expectoration spontanée des expectorations n’est pas possible, induire les expectorations comme décrit précédemment. Inhaler brièvement 200 μg de salbutamol, l’antagoniste des récepteurs β-2, avant de commencer la procédure d’induction des expectorations. Ensuite, inhalez une solution saline hypertonique (6 %) pendant 15 minutes à l’aide d’un nébuliseur. Prélevez les expectorations dans une boîte de Pétri
.
- Séparez les amas de mucus de la salive dans une boîte de Pétri à l’aide d’une pointe de pipette.
- Pesez le mucus.
note: Le poids moyen d’un échantillon de mucus est de 0,8 g (variant entre 0,1 g et 5 g) ; 0,1 g est généralement suffisant pour effectuer les procédures mentionnées.
- Ajouter 4 parties (v/p) de Sputolysine à 10 % (dans du PBS) aux expectorations (par exemple, 4 ml de Sputolysine à 10 % pour chaque gramme d’expectoration).
prudence: Sputolysin est composé de dithiothréitol concentré dans un tampon phosphate, donc manipulez-le avec précaution.
- Incuber le mélange à température ambiante (RT) sur un shaker à bascule pendant 15 min pour dissoudre le mucus. Pour des raisons de sécurité, placez le shaker dans une hotte.
- Éteindre la réaction en ajoutant le même volume de PBS froid (par exemple : 1 mL de PBS froid pour chaque mL de Sputolysine à 10 %).
- Mélanger par pipetage pour obtenir une solution homogène.
- Filtrez le mélange à travers une crépine en nylon de 100 μm dans un tube de 50 mL.
- Répétez l’étape de filtration à travers une crépine à cellules en nylon de 40 μm.
- Centrifuger la solution pendant 10 min à 300 x g à 4 °C.
- Transférez soigneusement la fraction surnageante dans un tube frais et conservez-la sur de la glace.
note: Les fractions surnageantes peuvent être stockées à -20 °C ou -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
- Remettez doucement la pastille cellulaire en suspension dans 500 μL de PBS froid et placez-la sur de la glace.
note: La fraction cellulaire doit être traitée immédiatement.
2. Mesure de l’activité de la protéase à sérine des neutrophiles
NOTE : Ici, différentes méthodes sont introduites pour quantifier l'activité de NSP au moyen de rapporteurs FRET. Le choix de la technologie est dicté par la question biomédicale spécifique et l’objectif de l’expérience. Les sondes présentées ont été testées de manière approfondie pour leur spécificité par rapport à un ensemble d’enzymes pertinentes pour les poumons. Bien que les sondes soient spécifiques à leur enzyme cible, vérifiez toujours la spécificité de la sonde sur l’échantillon clinique d’intérêt. Cela peut être réalisé en incubant l’échantillon avec un inhibiteur de protéase spécifique avant l’ajout de la sonde, ce qui devrait abolir toute augmentation du rapport donneur/accepteur (D/A).
- Quantification de l'activité soluble de la NSP par fluorimètre ou lecteur de plaques
note: L’activité de la protéase dans les fractions solubles de l’échantillon peut être détectée avec n’importe quel instrument capable de détecter la fluorescence.
- Décongeler les enzymes sur de la glace.
- Jusqu’à l’utilisation, conservez le NE et le CG dans un tampon de stockage acide (50 mM d’acétate de sodium, 200 mM de NaCl, pH 5,5) pour éviter l’auto-clivage.
- Pour établir une courbe standard enzymatique, préparer une dilution en série 1:2 de l’enzyme (33,9 - 0,271 nM pour l’EN ; 42,6 - 0,333 nM pour le CG) dans un tampon d’activation (10 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl à pH 7,5). Le tampon d’activation a un pH neutre et permet donc une catalyse enzymatique efficace.
- Pour préparer la concentration étalon la plus élevée (concentration en NE : 33,9 nM), diluez 1 μL d’EN (33,9 μM) dans 999 μL de tampon d’activation.
- Pour préparer le deuxième étalon (concentration EN : 16,95 nM), mélanger 200 μL de la première dilution avec 200 μL de tampon d’activation.
- Procédez en conséquence pour préparer les dilutions 1:2 restantes.
- La dernière norme, qui est l’épuration, est composée d’un tampon d’activation pur. Il est recommandé de mesurer les doublons ou les triplets techniques. Pendant la préparation de l’étalon et de l’échantillon, essayez de garder les flacons sur de la glace.
- Parallèlement à la préparation standard, diluer les échantillons d’expectorations dans un tampon d’activation. Diluer les échantillons humains avant d’évaluer leur activité protéase pour rester dans la plage linéaire d’augmentation du signal rapporteur (rapport D/A). Si les échantillons de patients n’étaient pas dilués, le clivage se produirait trop rapidement pour un ajustement fiable. Étant donné que les expectorations de donneurs sains contiennent moins de protéases actives que les échantillons prélevés sur des patients atteints de mucoviscidose (FK) et de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), différentes dilutions sont généralement effectuées (1:10 pour les expectorations surnageantes saines, 1:20-500 pour les expectorations surnageantes des patients atteints de BPCO ou de FK).
note: Afin de mesurer quantitativement l’activité de la protéase dans des échantillons dont la concentration est inconnue, une courbe standard avec des concentrations enzymatiques connues doit être mesurée en parallèle, idéalement sur la même plaque. La concentration d’enzyme active dans les expectorations humaines est calculée en interpolant les pentes mesurées dans les échantillons d’expectorations humaines avec celles mesurées avec les courbes standard.
- Avant de préparer les échantillons pour la mesure, installez l’instrument. Réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde NE Förster basée sur le transfert d’énergie de résonance (NEmo-1) à 354 nm et réglez la longueur d’onde de détection à 400 nm pour le donneur et à 490 nm pour l’accepteur. Réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde FRET CG (sSAM) sur 405 nm et réglez l’émission sur 485 (donneur) et 580 nm (accepteur).
- Ajouter 40 μL d’échantillons, étalons ou blancs, dans les puits d’une plaque noire de 96 puits à demi-surface.
- Pour préparer le mélange maître contenant les rapporteurs (concentration du rapporteur dans le mélange maître : 10 μM), diluer le stock de sonde (1 mM dans le diméthylsulfoxyde de méthyle, DMSO) 1:100 dans le tampon d’activation. Préparez le volume de mélange principal nécessaire en multipliant 10 μL par le nombre de puits de plaque requis. Pour atteindre la concentration finale optimale (2 μM) pour la mesure de fluorescence des rapporteurs NEmo-1 et sSAM, ajoutez 10 μL du mélange maître dans chaque puits (contenant 40 μL d’échantillon, d’étalon ou de blanc) et démarrez la lecture. Les rapporteurs NEmo-1 et sSAM surveilleront donc respectivement l’activité de l’élastase soluble des neutrophiles et de la cathepsine G.
note: Si un injecteur de réactif n’est pas disponible, assurez-vous de commencer la lecture dès que possible après l’ajout du rapporteur aux échantillons.
- Démarrez la mesure du lecteur de plaques et enregistrez l’augmentation du rapport D/A toutes les 60 à 90 secondes pendant au moins 20 minutes ou jusqu’à ce que l’augmentation du signal atteigne un plateau.
- Une fois les données exportées, calculez le rapport D/A en divisant les unités de fluorescence relative (RFU) du donneur par la RFU de l’accepteur pour chaque point temporel et échantillon.
- Calculez la moyenne et l’écart type du rapport D/A de chaque échantillon.
- Déterminez la pente dans la croissance linéaire de la variation du rapport D/A. La pente est un indicateur du taux de clivage enzymatique d’une sonde FRET. Calculez la concentration d’enzyme active dans les expectorations en ajustant les pentes de régression linéaires dérivées des échantillons humains avec celles calculées à partir de l’étalon enzymatique.
