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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du dispositif microfluidique.
- Préparation du test de migration cellulaire microfluidique
- Préparez une solution de fibronectine de 50 μg/mL en diluant 50 μL de solution mère de fibronectine (1 mg/mL) dans 950 μL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) à l'intérieur d'une enceinte de biosécurité.
- Préparez le milieu de migration en mélangeant 9 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) et 1 ml de RPMI-1640 avec 4 % d’albumine sérique bovine (BSA).
- Retirez l’eau déminéralisée de l’appareil.
- Ajoutez 100 μL de solution de fibronectine dans l’appareil à partir de la sortie. Attendez 3 minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis d’une solution de fibronectine. Placez le dispositif microfluidique dans une boîte de Pétri couverte pendant 1 h à température ambiante.
- Retirez la solution de fibronectine de l’appareil. Ajouter 100 μL de fluide de migration à partir de la sortie. Attendez 3 min pour vous assurer que tous les canaux sont remplis de support de migration.
- Incuber l’appareil pendant encore 1 h à température ambiante ; l’appareil est alors prêt pour l’expérience de chimiotaxie.
- Préparation d’une solution chimioattractante pour l’expérience de chimiotaxie.
- Préparez une solution fMLP de 100 nM dans un support de migration de 1 mL au total. Mélanger 5 μL de FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) avec la solution fMLP dans un tube de 1,5 mL.
note: FITC-Dextran est utilisé pour la mesure de gradient. Vous pouvez également utiliser de la rhodamine comme indicateur de gradient. La solution de chimioattractant fMLP est alors prête pour l’expérience de chimiotaxie.
- Préparation d’échantillons d’expectorations.
note: La chimiotaxie neutrophile induite par un gradient d’échantillons d’expectorations de patients atteints de BPCO a été testée en tant qu’application diagnostique clinique de cette méthode tout-sur-puce.
- Obtenir un protocole d’éthique humaine pour prélever des échantillons d’expectorations chez les patients atteints de MPOC.
note: Nous avons obtenu l’autorisation de prélever des échantillons à l’Hôpital général Seven Oaks de Winnipeg (approuvée par l’Université du Manitoba).
- Obtenez les formulaires de consentement écrit éclairé de tous les sujets.
- Prélever des échantillons d'expectorations spontanées de patients atteints de MPOC. Placez un échantillon d’expectoration de 500 μL dans un tube de 1,5 mL.
- Ajouter 500 μL de dithiothréitol à 0,1 % dans le tube de 1,5 mL et mélanger délicatement. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min.
- Centrifuger l’échantillon à 753 x g pendant 10 min, puis prélever le surnageant. Centrifugez le surnageant à 865 x g pendant 5 min, puis récupérez le surnageant final. Conservez le surnageant collecté dans un congélateur à -80 °C avant utilisation.
- Lorsqu’il est prêt pour l’expérience de chimiotaxie, décongeler la solution d’expectoration ; transférer le milieu de migration de 900 μL dans un tube de 1,5 mL et mélanger avec une solution d’expectoration de 100 μL à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique ; la solution d’expectoration est alors prête pour l’expérience de chimiotaxie.
- Prélèvement d’échantillons de sang.
- Obtenir un protocole d’éthique humaine pour prélever des échantillons de sang sur des donneurs sains. Obtenez les formulaires de consentement écrit éclairé de tous les donneurs de sang.
note: Des échantillons ont été prélevés à l’Hôpital général Victoria de Winnipeg (approuvés par le Comité mixte d’éthique de la recherche de l’Université du Manitoba).
- Prélevez l’échantillon de sang par ponction veineuse et placez-le dans un tube recouvert d’EDTA. Conservez le tube dans une enceinte de biosécurité avant l’expérience.
2. Fonctionnement du test de chimiotaxie tout-en-puce
- Isolement de cellules sur puce (Figure 1B).
- Placez 10 μL de sang total dans un tube de 1,5 mL à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.
note: Les détails du prélèvement d’échantillons de sang se trouvent à la section 1.4.
- Ajoutez 2 μL de cocktail d’anticorps (Ab) et 2 μL de particules magnétiques (MP) du kit d’isolement des neutrophiles (voir le tableau des matériaux) dans le tube de 1,5 mL et mélangez délicatement, ce qui permettra de marquer les cellules dans le sang à l’exception des neutrophiles.
- Incuber le mélange sang-Ab-MP pendant 5 minutes à température ambiante.
note: Cela marquera magnétiquement les cellules marquées par des anticorps dans le sang.
- Fixez deux petits disques magnétiques sur les deux côtés de l’orifice de chargement de cellule de l’appareil. Aspirez le support de tous les ports de l’appareil.
- Pipeter lentement 2 μL de mélange sanguin-Ab-MP dans le dispositif microfluidique à partir de l’orifice de chargement de la cellule.
REMARQUE : Les cellules marquées magnétiquement sont piégées sur les parois latérales de l’orifice de chargement des cellules tandis que les neutrophiles s’écoulent dans l’appareil et sont piégés au niveau de la structure d’amarrage des cellules.
- Attendez quelques minutes jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de neutrophiles soient piégés dans la zone d’amarrage cellulaire.
3. Dosage de la chimiotaxie (Figure 1C).
- Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope à température contrôlée à 37 °C.
- Ajouter une solution de chimioattractant de 100 μL (fMLP ou solution d’expectoration) et un milieu de migration de 100 μL dans leurs réservoirs d’entrée désignés à l’aide de deux pipettes ; cela générera un gradient de chimioattractant dans le canal de gradient par un mélange chimique continu basé sur un flux laminaire assisté par une structure d’équilibrage de pression.
note: Les détails de la collecte d’expectorations chez les patients atteints de BPCO sont disponibles à la rubrique 1.3.
- Pour l’expérience de contrôle du milieu, n’ajouter du milieu de migration que dans les deux réservoirs d’entrée.
- Acquérir l’image de fluorescence de FITC-Dextran dans le canal de gradient.
- Importez l’image dans le logiciel ImageJ à l’aide de la commande "File|Ouvert".
- Mesurez le profil d’intensité de fluorescence sur le canal de gradient à l’aide de la commande "Analyser|Profil de l’intrigue".
- Exportez les données de mesure vers une feuille de calcul pour un traçage ultérieur.
- Incuber l’appareil sur la platine du microscope à température contrôlée ou dans un incubateur de culture cellulaire conventionnel pendant 15 min.
- Imagez le canal de gradient à l'aide d'un objectif 10X pour enregistrer les positions finales des cellules pour l'analyse des données.
- Si nécessaire, enregistrez la migration cellulaire dans l’appareil par microscopie time-lapse.
4. Analyse des données de migration cellulaire (Figure 1C)
- Analysez le test de chimiotaxie en calculant la distance de migration cellulaire à partir de la structure d’amarrage, comme décrit ci-dessous. Voir la figure 1C.
- Importez l’image dans le logiciel NIH ImageJ (ver. 1.45).
- Sélectionnez le centre de chaque cellule qui s’est déplacée dans le canal de dégradé.
- Mesurez les coordonnées des cellules sélectionnées pour leurs positions finales. Mesurez la coordonnée d’un point au bord de la structure d’amarrage comme position de référence initiale.
- Exportez les données de coordonnées mesurées vers un tableur (par exemple Excel). Calculez la distance de migration des cellules comme la différence entre la position finale d'une cellule et la position de référence initiale le long de la direction du dégradé.
- Calibrez la distance au micromètre. Calculez la moyenne et l’écart de la distance de migration de toutes les cellules comme mesure de la chimiotaxie.
- Comparez la distance de migration en présence d'un gradient de chimioattractant à l'expérience de contrôle du milieu à l'aide du test t de Student.
- Si les images en accéléré de la migration cellulaire sont enregistrées, la migration cellulaire et la chimiotaxie peuvent être analysées plus en détail par analyse de suivi cellulaire.
note: Les matériaux nécessaires à la construction et à la réalisation du test de chimiotaxie tout-sur-puce sont détaillés dans le tableau des matériaux.
