Un test in vitro pour l’étude de la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+ préactivés contre les cellules cancéreuses

Résumé

Source : Kitamura, T., et al. Détection en temps réel de l’apoptose des cellules tumorales in vitro induite par les lymphocytes T CD8⁺ pour étudier les fonctions immunosuppressives des cellules myéloïdes infiltrant la tumeur. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente un test d’apoptose dans des cellules cancéreuses induit par des cellules T effectrices pré-activées. En co-cultivant ces cellules avec des cellules cancéreuses marquées par des noyaux fluorescents, un substrat fluorogénique clivable par caspase est ajouté. Les cellules cancéreuses apoptotiques afficheront une couleur différente dans leur noyau, conduisant à une double fluorescence. Cette double fluorescence est révélatrice de cellules cancéreuses en apoptose.

Protocole

1. Préparation de cellules cibles exprimant la protéine fluorescente rouge dans leurs noyaux

1. Obtenez une lignée cellulaire cible de cancer de souris à partir d’une source appropriée.
   note: Dans ce protocole, un dérivé hautement métastatique des cellules tumorales mammaires de souris E0771 (E0771-LG) est utilisé. Les cellules parentales E0771 proviennent de souris C57BL/6.
2. Décongeler et conserver un flacon de cellules E0771-LG avec le milieu modifié Dulbecco's Eagles (DMEM) comprenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 95 % d'humidité et 5 % de CO₂,
   note: Il faut confirmer que les cellules sont négatives pour le mycoplasme. À cette fin, cultivez des cellules E0771 (ou des cellules à tester) pendant 2 à 3 jours comme décrit ci-dessus (en l’absence d’antibiotiques et d’antimycosiques), et prélevez 500 μL de milieu de culture. Centrifuger le milieu à 12 419 x g pendant 60 s pour éliminer les débris cellulaires et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Déterminer la contamination par les mycoplasmes à l'aide d'une trousse d'analyse des mycoplasmes disponible dans le commerce (voir la Table des matières) et/ou d'une PCR en suivant les instructions du fabricant.
3. Semez 5 x 10³ cellules E0771-LG par puits dans une plaque de 12 puits et cultivez les cellules avec 10 % (v/v) de FBS-DMEM pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C, à 95 % d’humidité et à 5 % de CO₂,
   note: Si le taux de prolifération des cellules cibles est faible (temps de doublement de la population supérieur à 36 h), le nombre de cellules peut être porté à 1 x 10⁴.
4. Remplacer le milieu par 1 mL de FBS-DMEM à 10 % (v/v) comprenant 10 μg/mL de polybrène et ajouter 25 μL de particules lentivirales (1 x 10⁶ TU/mL) codant pour une protéine fluorescente rouge restreinte à l’énergie nucléaire (mKate2, voir le tableau des matières).
5. Cultivez les cellules pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂.
6. Remplacer le milieu par 10 % (v/v) de FBS-DMEM et cultiver les cellules pendant 24 à 48 h dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂.
7. Remplacer le milieu par 10 % (v/v) de FBS-DMEM comprenant 1 μg/mL de puromycine lorsque les cellules commencent à exprimer une protéine fluorescente rouge, et cultiver les cellules jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80-90 %.
   note: La concentration de puromycine sera différente entre les types de cellules cibles et devrait être optimisée à l’aide de cellules non transfectées.
8. Sous-culturer les cellules survivantes pour 1 à 3 passages avec 10 % (v/v) de FBS-DMEM, y compris 1 μg/mL de puromycine, et cryoconserver les stocks dans un système de stockage en phase vapeur d’azote liquide jusqu’à l’utilisation.

2. Isolement des cellules suppressives des tumeurs chez la souris

REMARQUE : Dans ce protocole, les cellules suppressives (c’est-à-dire les macrophages associés aux métastases (MAMs) et les cellules suppressives dérivées de la myéloïde monocytaire (M-MDSC)) sont isolées du poumon contenant des tumeurs métastatiques établies par les cellules E0771-LG. Les conditions de dissociation des tissus et de tri cellulaire doivent être optimisées pour isoler les cellules de différents tissus.

1. Injecter 1 x 10 cellules cancéreuses⁶ (E0771-LG) dans la veine de la queue de souris syngéniques (C57BL/6), femelles, âgées de 7 à 10 semaines.
2. Après 14 jours, isolez le poumon contenant des tumeurs métastatiques et préparez des suspensions unicellulaires à partir des poumons perfusés par digestion enzymatique comme décrit précédemment.
   note: Dans ce protocole, quatre souris sont injectées avec des cellules cancéreuses et leurs poumons métastatiques sont combinés pour obtenir suffisamment de cellules suppressives.
3. Incuber les suspensions unicellulaires avec des anticorps anti-souris CD16/CD32 pendant 30 minutes sur de la glace, et les colorer avec des anticorps fluorescents contre CD45, F4/80, CD11b, Ly6C et Ly6G (voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes supplémentaires.
4. Lavez une fois les cellules colorées avec 1 mL de PBS contenant 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA), et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 500 à 1000 μL de PBS contenant 2 % (p/v) de BSA.
5. Ajoutez 3 μM de DAPI et triez les M-MDSC (DAPI-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^élevé, Ly6C ^élevé) et les MAM (DAPI-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^élevé, Ly6C^faible) à l’aide d’un trieur de cellules (Figure 1).
   note: Le seuil de niveau Ly6C pour distinguer les MAM (Ly6Clow) et les M-MDSC (Ly6Chigh) est basé sur celui des macrophages alvéolaires résidents (RMAC). La pureté des cellules triées est mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de plus de 90 %.
6. Remettre en suspension les cellules triées avec 400 μL de DMEM contenant 20 % (v/v) de FBS, 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1 % (v/v) d’acide aminé non essentiel, 1 mM de pyruvate de sodium et 50 nM de 2-mercaptoéthanol (appelé DMEM-enrichi, E-DMEM).
7. Comptez le nombre de cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de Trypan et ajustez à 2 x 10⁶ cellules/mL avec E-DMEM.
8. Gardez les cellules sur de la glace jusqu’à utilisation.

3. Isolement des lymphocytes T CD8⁺ de la rate de souris

1. Isolez la rate d’une souris syngénique avec la lignée cellulaire cancéreuse cible (c’est-à-dire les souris C57BL/6 dans ce protocole) comme suit :
   1. Euthanasier l’animal par inhalation de CO₂.
   2. Placez l’animal sur une planche de dissection propre et essuyez la peau avec de l’éthanol à 70 % (v/v).
   3. Couper la peau abdominale à l’aide de ciseaux pour exposer la rate
   4. Isolez la rate, qui est située à la partie inférieure de l’estomac, et placez-la dans un tube contenant 5 ml de PBS glacé.
2. À l’aide du piston intérieur d’une seringue stérile de 5 ml, broyer la rate sur une passoire à cellules de 100 μm posée sur un tube de 50 mL.
3. Passez les cellules à travers le filtre en utilisant un total de 10 ml de PBS.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à 337 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
5. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de PBS contenant 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 0,5 % (p/v) de BSA (tampon courant) et filtrer à travers une crépine de 40 μm.
6. Comptez le nombre de cellules actives et ajustez à 1 x 10⁸ cellules/ml à l’aide de la mémoire tampon en cours.
   note: Conservez une petite aliquote de cellules comme échantillon de pré-enrichissement pour un contrôle de pureté.
7. Enrichissez pour les lymphocytes T CD8⁺ à l’aide d’un kit de sélection négative et d’un trieur magnétique (voir la Table des matières).
   1. Transvaser 1 x 10⁸ (1 ml) des cellules splénocytaires dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml.
   2. Ajouter 50 μL d’anticorps biotinylés et incuber à température ambiante pendant 10 min.
   3. Ajouter 125 μL de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   4. Ajouter 1,325 mL de tampon coulant et mélanger doucement par pipetage.
   5. Placez le tube dans l’aimant et incubez à température ambiante pendant 2,5 min.
   6. Prenez l’aimant et versez la suspension de cellules enrichie dans un nouveau tube.
8. Remettre les cellules enrichies en suspension avec 200 μL d’E-DMEM (c.-à-d. du DMEM contenant 20 % (v/v) de FBS, 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1 % (v/v) d’acide aminé non essentiel, 1 mM de pyruvate de sodium et 50 nM de 2-mercaptoéthanol).
9. Comptez le nombre de cellules vivantes et ajustez à 2 x 10⁶ cellules/ml avec E-DMEM. Maintenir les cellules à 37 °C dans un incubateur de CO₂ jusqu’à utilisation.
   note: Conservez une petite aliquote de cellules comme échantillon post-enrichissement pour un contrôle de pureté.
10. Déterminer la pureté des lymphocytes T CD8⁺ par cytométrie en flux comme suit :
    1. Prélever 1 x 10 cellules 4 des échantillons de pré-enrichissement (étape 3.6) ou de post-enrichissement (étape 3.9) et ajuster le volume total de chacune à 100 μL à l’aide d’une mémoire tampon courante.
    2. Incuber les suspensions unicellulaires avec des anticorps anti-souris CD16/CD32 pendant 30 minutes sur de la glace, et les colorer avec des anticorps fluorescents contre CD45, CD3, CD4 et CD8 (voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes supplémentaires.
    3. Lavez les cellules colorées avec 500 μL de PBS contenant 2 % (p/v) de BSA, et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 500 à 1000 μL de PBS contenant 2 % (p/v) de BSA.
11. Ajoutez 3 μM de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et déterminez le pourcentage de cellules CD3⁺CD4-CD8⁺ dans la population totale de cellules CD45⁺.

4. Activation et expansion des lymphocytes T CD8⁺ isolés

1. Aliquote 1 x 10⁵ cellules par 50 μL de cellules T CD8⁺ (préparées à l’étape 3.9) dans les puits d’une plaque à fond en U à 96 puits.
2. Ajouter 1 x 10⁵ cellules par 50 μL de cellules suppressives (préparées à l’étape 2.7) ou 50 μL d’E-DMEM dans les puits.
3. Préparez un milieu d’activation composé d’E-DMEM, de 4 x 10 4 U/mL de facteur de stimulation des colonies 1 (LCR-1), de 240 U/mL d’interleukine-2 (IL-2), de 8 μg/mL d’anticorps CD3ε anti-souris et de 16 μg/mL d’anticorps CD28 anti-souris.
   note: Le CSF-1 n’est pas nécessaire à l’activation des lymphocytes T, mais il est essentiel à la survie des cellules suppressives dans ce protocole (c’est-à-dire les MAM et les M-MDSC). Ainsi, il est conservé dans la co-culture des lymphocytes T avec les cellules cancéreuses cibles pour maintenir la cohérence dans des conditions de culture. Étant donné que le CSF-1 se trouve à des concentrations nanomolaires dans tous les tissus et qu’il est nécessaire à la viabilité des monocytes/macrophages in vivo, il s’agit d’un contexte physiologique pour ces cellules.
4. Ajouter 50 μL de milieu d’activation (étape 4.3) et 50 μL d’E-DMEM avec ou sans réactifs à tester.
5. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO_2, et cultivez les cellules pendant 4 jours.

5. Mise en place de la co-culture de cellules cibles avec des lymphocytes T CD8⁺ pré-activés

1. Ajouter 30 μL de matrice de membrane basale soluble à facteur de croissance réduit dilué 1:100 (tableau des matériaux) dans les puits d’une plaque à fond plat à 96 puits adaptée à la microscopie, et incuber à 37 °C dans un incubateur de CO₂ pendant au moins 1 h.
2. Préparez des cellules cibles (c’est-à-dire des cellules E0771-LG exprimant une protéine fluorescente rouge restreinte au nucléaire).
   1. Incuber les cellules cibles avec 1 mL de trypsine/EDTA à 0,05 % à température ambiante pendant 1 min, et récolter les cellules par pipetage doux.
   2. Ajouter 9 mL de DMEM, y compris 10 % (v/v) de FBS, et centrifuger la suspension cellulaire à 337 x g pendant 5 min.
   3. Remettez les cellules en suspension avec 500 μL d’E-DMEM et comptez le nombre de cellules vivantes.
      note: Avant de compter les cellules cibles, filtrez les cellules à travers une passoire de cellules de 40 μm pour produire une suspension unicellulaire.
   4. Ajustez la densité à 2 x 10⁴ cellules/mL (= 1 x 10³ cellules par 50 μL) en ajoutant de l’E-DMEM, et gardez les cellules sur de la glace.
3. Préparez les cellules effectrices (c.-à-d. les lymphocytes T CD8⁺ préactivés).
   1. Remettre les cellules en suspension dans un puits d’une plaque de 96 puits (étape 4.5) à l’aide d’un pipetage, puis transférer les cellules T CD8⁺ flottantes dans un nouveau tube de 1,5 mL.
      note: Les MAM et les M-MDSC adhèrent étroitement au puits et ne sont pas détachés par le pipetage.
   2. Pour recueillir les cellules restantes, ajoutez 200 μL de PBS dans le puits et transférez-le dans le tube à l’étape 5.3.1.
   3. Lavez une fois les cellules avec 1 mL d’E-DMEM (centrifugeuse à 337 x g) pendant 5 min, aspirez et jetez le surnageant), et mettez-les en suspension avec 100 μL d’E-DMEM.
   4. Comptez le nombre de cellules vivantes (à l’aide de la méthode d’exclusion au bleu de trypan), ajustez la densité à 1,6 x 105 cellules/mL (= 4 x 10³ cellules/25 μL) et gardez les cellules sur de la glace.
4. Aspirez la matrice de la membrane basale de chaque puits de la plaque à l’étape 5.1.
5. Ajouter 1 x 10³ cellules/50 μL de cellules cibles (étape 5.2.4) dans chaque puits et bien mélanger.
   note: Pour éviter les effets de bord dus à l’évaporation du fluide, seuls les 60 puits intérieurs de la plaque de 96 puits doivent être utilisés pour l’analyse.
6. Ajouter 25 μL d’E-DMEM, y compris 4 substrats de 10 3 U/mL IL-2 et 10 μM de caspase-3 fluorogène (voir le Tableau des matériaux).
7. Ajouter 4 x 10³ cellules/25 μL de lymphocytes T CD8⁺ (étape 5.3.4) dans les puits appropriés et bien mélanger.
   note: La présence d’un trop grand nombre de cellules dans un puits rend l’analyse plus difficile. Dans ce modèle, un rapport effecteur/cible de 4:1 (nombre total de cellules 5 x 10³ cellules/puits) était optimal, mais un rapport de 8:1 était sous-optimal. Des puits contenant les quatre contrôles suivants sont nécessaires pour faciliter l’analyse des données : cellules cibles à la densité utilisée pour les puits de co-culture (1 x 10 3 cellules/puits) dans un milieu avec et sans substrat de caspase-3, cellules effectrices (1 x 10³ cellules/puits) dans un milieu avec et sans substrat de caspase-3.
8. Ajouter 200 μL de PBS ou d’eau stérile dans tous les puits vides (en particulier les puits à la périphérie de la plaque) pour réduire l’évaporation du milieu des puits expérimentaux.
9. Placez la plaque dans un microscope à fluorescence time-lapse maintenu à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂,
   note: Secouez la plaque en croix pour répartir uniformément toutes les cellules, puis laissez la plaque rester à température ambiante sur une surface plane pendant 10 à 20 minutes avant de la transférer dans l’incubateur.

6. Imagerie des cellules

REMARQUE : Les paramètres détaillés d’acquisition d’images varient en fonction du microscope et des fluorophores utilisés ; les paramètres généraux d’acquisition suivants doivent être utilisés pour des résultats optimaux.

1. À l’aide d’une routine de mise au point automatique appropriée sur le microscope, obtenez des images couvrant au moins 25 % de la surface totale de chaque puits expérimental de la plaque à 96 puits.
2. Réglez le microscope pour qu’il acquière des images en contraste de phase ainsi qu’un canal fluorescent adapté à la protéine fluorescente rouge restreinte au nucléaire (mKate2) et un canal fluorescent adapté au substrat vert fluorogène activé de la caspase-3 (avec excitation à 488 nm) (Figure 2).
3. Capturer des images dans des puits expérimentaux en contraste de phase et les 2 canaux fluorescents toutes les 1 à 3 h pendant au moins 72 h.

Résultats

Graphique 1. Stratégie de déclenchement pour isoler les cellules suppressives du poumon métastatique. (A) Diagrammes représentatifs pour isoler les cellules suppressives dérivées de myéloïdes monocytaires (M-MDSC) et les macrophages associés aux métastases (MAM). Le seuil de niveau de Ly6C pour distinguer les MAM (^{Ly6C faible}) et les M-MDSC (Ly6C^élevé) es...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % de trypsine EDTA (1X)	Gibco	Référence 25300-054
Plaque de culture cellulaire à 12 puits	Freiner Bio-One	665 à 180
1x PBS	Gibco	Référence 14190-094
2-mercaptéthanol	sigma	M6250-10ML
Tube à fond rond en plystyrène de 5 ml	Faucon	352054
Plaque de culture cellulaire à 96 puits (fond rond)	Costar	Référence 3799	Co-culture de lymphocytes T CD8+ avec des cellules myéloïdes triées
Plaque à 96 puits (fond plat)	Nunc	165305	Co-culture de lymphocytes T CD8+ avec des cellules cibles pour le test de cytotoxicité
AF647 anti-souris F4/80 Anticorps	BIO-RAD	MCA497A647	Clone : CIA3-1, Lot # : 1707, 2 μL/1x10^6 cellules
AlexaFluor700 Anticorps anti-souris CD8	Biolégende	Référence 100730	Clone : 53-6,7, # de lot : B205738, 0,5 μL/1x10^6 cellules
anticorps anti-souris CD28	Biolégende	102111	Activation de lymphocytes T CD8+ isolés, Clone : 37,51, Lot# : B256340
anticorps anti-souris CD3e	Biolégende	100314	Activation de lymphocytes T CD8+ isolés, Clone : 145-2C11, Lot # : B233720
Anticorps CD3 anti-souris APC	Biolégende	100236	Clone : 17A2, # de lot : B198730, 0,5 μL/1x10^6 cellules
Anticorps anti-souris Ly6C APC/Cy7	Biolégende	128026	Clone : HK1.4, Lot # : B248351, 1 μL/1x10^6 cellules
Sérum bovin Albmin	sigma	A1470-100G
Filtre cellulaire (nylon 100μm)	Faucon	Référence 352360	Pour briser la rate
Crépine cellulaire (nylon 40μm)	Faucon	Référence 352340	Pour filtrer la digestion pulmonaire
DAPI	Biolégende	422801
moyen modifié de l’aigle de Dulbecco	Gibco	Référence 41966-029
d’isolement des lymphocytes T CD8+ de souris EasySep	Technologies StemCell	19853
Sérum fœtal bovin	Gibco	Référence 10270-106
Anticorps CD4 anti-souris FITC	Biolégende	100406	Clone : GK1.5, Lot # : B179194, 0,5 μL/1x10^6 cellules
Geltrex prêt à l’emploi	Gibco	N° A1596-01	Revêtement des plaques à 96 puits pour le test de cytotoxicité
Réactif de lentivirus rouge IncuCyte NucLight	Essen BioScience	4476	Particules virales lenti codant pour mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Détecteur (microscope à fluorescence)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Logiciel d’analyse
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Kit de dissociation pulmonaire	Miltenyi	Tél. : 130-095-927	Préparation d’une suspension unicellulaire à partir d’un poumon porteur d’une tumeur
Kit de détection de mycoplasmes MycoAlert	Lonza	Réf. LT07-318
Acide aminé non essentiel (100X)	Gibco	Référence 11140-035
NucView488	Biotium	Référence 10403	Substrat fluorégène de la caspase-3
Anticorps PE anti-souris Ly6G	Biolégende	127607	Clone : 1A8, # de lot : B258704, 0,5 μL/1x10^6 cellules
Anticorps CD11b anti-souris PE/Cy7	Biolégende	101216	Clone : M1/70, # de lot : B249268, 0,5 μL/1x10^6 cellules
Streptocoque de stylo	Gibco	Référence 15140-122	Pénicilline Streptomycine pour la culture primaire de cellules
Anticorps anti-souris CD45 PerCP/Cy5.5	Biolégende	103132	Clone : 30-F11, Lot # : B249564, 0,5 μL/1x10^6 cellules
Polybrène (bromure d’hexadiméthrine)	sigma	N° H9268
Puromycine	Gibco	Référence A11138-03
Coussin de lyse RBC (10X)	Biolégende	420301
IL-2 murine recombinante	Peprotech	212-12	Activation des lymphocytes T CD8+ isolés
Pyruvate de sodium (100X)	Gibco	Référence 11360-070
Anticorps TruStain fcX (anti-souris CD16/32)	Biolégende	Référence 101320

Le Kit