Évaluation de l’activation de plusieurs caspases dans les macrophages

Résumé

Source : Han, J. et al., Évaluation de l’activation de la caspase pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées.J. Vis. Exp.(2023)

Cette vidéo démontre l’évaluation de multiples activations de caspases dans des macrophages dérivés de la moelle osseuse par stimulation avec le virus de la grippe. Après la lyse des macrophages, l’inactivation thermique du lysat et la centrifugation, des caspases intracellulaires sont collectées pour une analyse immunologique ultérieure.

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparez un support conditionné L929.
   1. Planche 1 × 10⁶ cellules L929 (voir le tableau des matériaux) dans une fiole de culture tissulaire de^{182 cm 2} contenant 50 mL de milieu de culture L929 (voir le tableau 1 pour la préparation du milieu).
   2. Cultivez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone, CO₂.
   3. Après 7 jours, récupérez le surnageant et filtrez à l’aide d’un filtre de 0,45 μm. Préparez 50 mL d’aliquotes (conservez les aliquotes congelées à −80 °C jusqu’à 1 an).
2. Préparez 500 ml de milieu de culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) (tableau 1).
3. Préparez 500 mL de milieu de stimulation de la BMDM (tableau 1).
4. Préparez 500 ml de milieu pour l’infection (tableau 1).
5. Préparez 100 ml de tampon Tris de 1 M (tableau 1).
6. Préparez 4 tampons de dodécylsulfate de sodium (SDS) (Tableau 1).
7. Préparer 1 mL de 1 M 1,4-dithiothréitol (DTT, tableau 1).
8. Préparez 40 mL de tampon de lyse de caspase (tableau 1).
9. Préparez 100 ml de tampon Tris de 1,5 m (tableau 1).
10. Préparez 100 mL d’une solution de FDS à 10 % (poids/vol) (tableau 1).
11. Préparer 50 mL d’un tampon d’essai de radio-immunoprécipitation (RIPA) 2x (tableau 1).
12. Préparer une solution de lipopolysaccharide de LPS à 5 mg/mL (tableau 1).
13. Préparez une solution d’adénosine triphosphate 0,5 M, ATP (tableau 1).
14. Préparez les solutions de transfert Western.
    1. Préparez 1 L de 5 doses de stock tampon (tableau 1).
    2. Préparez 1 L de 10 tampons de transfert (tableau 1).
    3. Préparez 1 L de solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST, tableau 1).
    4. Préparez 100 mL d’une solution de blocage du lait écrémé à 5 % (poids/vol) (tableau 1).
15. Préparez les solutions d’anticorps primaires.
    1. Préparez 10 mL d’anticorps primaire contre la caspase-1 (tableau 1).
    2. Préparez 10 ml d’anticorps primaire à la caspase-11 (tableau 1).
    3. Préparez 10 ml d’anticorps primaire contre la caspase-3 (tableau 1).
    4. Préparez 10 ml d’anticorps primaire contre la caspase-7 (tableau 1).
    5. Préparez 10 ml d’anticorps primaire contre la caspase-8 (tableau 1).
    6. Préparez 10 mL d’anticorps primaire contre la caspase-9 (tableau 1).
    7. Préparez 10 ml d’anticorps primaire β-actine conjugué à la HRP (tableau 1).
16. Préparez les solutions secondaires d’anticorps.
    1. Préparez 10 mL d’anticorps secondaire anti-lapin (tableau 1).
    2. Préparez 10 ml d’anticorps secondaire anti-souris (tableau 1).
    3. Préparez 10 ml d’anticorps secondaire anti-rat (tableau 1).

2. Isolement des macrophages dérivés de la moelle osseuse

REMARQUE : Pour ce protocole, on peut utiliser des souris de type sauvage âgées de 6 à 10 semaines avec des voies de mort cellulaire programmée (DCP) intactes ou des souris mutantes dont les régulateurs, effecteurs ou molécules d’intérêt de la DCP ont été supprimés ou modifiés.

1. Euthanasier une souris dans une chambre de CO₂ avec un débit qui déplace 10 à 30 % du volume de la cage par minute pendant 2 à 3 minutes. Ensuite, effectuez une méthode d’euthanasie secondaire, telle que la luxation cervicale. Suivez toutes les directives et réglementations supplémentaires spécifiques aux établissements, aux institutions et au gouvernement, le cas échéant.
2. Disséquez la souris pour récupérer les os de la patte arrière.
   1. Épinglez la souris sur son dos pour que l’abdomen soit exposé. Pulvériser avec de l’éthanol à 70 % (vol/vol) pour stériliser les pattes arrière et l’abdomen.
      prudence: L’éthanol est inflammable. Gardez-le à l’écart des flammes nues.
   2. À l’aide de ciseaux, faites une incision sur la ligne médiane de l’abdomen ; continuez à couper vers les jambes pour rendre les fémurs visibles.
   3. Prenez la patte arrière droite et tirez la peau loin du corps vers la ligne médiane. Détacher la jambe du corps en sectionnant les muscles adducteurs vers la ligne médiane ; Ensuite, coupez la jambe entre l’articulation de la hanche et la colonne vertébrale. Ensuite, coupez la patte distale de la cheville et retirez l’excès de tissu de l’os en décollant la peau et en utilisant des ciseaux légèrement ouverts pour enlever le tissu du mollet.
   4. Placez la jambe sur une serviette imbibée d’éthanol à 70 % (vol/vol) et disséquez le tibia et le fémur.
      1. Saisissez le tibia et le fémur à l’aide d’une pince séparée. Appuyez doucement le tibia contre la direction naturelle de l'articulation du genou ; Cela provoquera la rupture du tibia au niveau du genou.
      2. Utilisez la pince et les ciseaux de dissection si nécessaire pour retirer tout tissu suspendu restant. Conservez le tibia pour une utilisation ultérieure en le plaçant sur la serviette imbibée d’éthanol.
      3. Récupérez le fémur de la même manière, en cassant le genou.
   5. Répétez les étapes 3 et 4 ci-dessus pour la jambe gauche afin de la retirer du corps et de disséquer le tibia et le fémur.
   6. Vaporisez les os avec de l’éthanol à 70 % (vol/vol).
   7. Nettoyez les os en les plaçant sur une serviette propre imbibée d’éthanol à 70 % (vol/vol), en pressant la partie charnue de la serviette et en frottant la serviette contre l’os pour éliminer l’excès de tissu.
3. Une fois que les deux fémurs et les deux tibias sont propres, vaporisez les quatre os avec de l’éthanol à 70 % (vol/vol). Prélever les os dans une boîte de Pétri stérile et les rincer avec 10 ml de milieu de culture BMDM en remuant doucement le milieu dans la boîte.
4. Remplissez une seringue de 10 ml avec 10 ml de milieu de culture BMDM frais et fixez-y une aiguille de 25 g.
5. Ramassez le tibia à l’aide d’une pince, puis coupez l’articulation de la cheville à un angle de ~45°.
6. Rincer la moelle osseuse du tibia.
   1. Tenez le tibia au-dessus d’un tube de 50 ml, avec l’extrémité étroite du tibia dirigée vers le bas. Distribuez le média sur le tibia à partir de la seringue remplie.
   2. Insérez l’aiguille (doucement au début) à l’extrémité supérieure de la moelle et distribuez le support.
   3. Retirez l’aiguille puis insérez-la à nouveau. Utilisez des poussées courtes et à haute pression pour distribuer le support et déplacer l’aiguille dans la moelle.
   4. Une fois que le milieu commence à s’écouler du bas de l’os, utilisez des poussées courtes et à haute pression pour continuer à rincer les cellules. Surveillez la couleur de l’os pendant ce processus et, lorsque l’os est blanc, jetez-le.
   5. Faites cela pour les deux tibias.
7. Répétez les étapes 5 et 6 ci-dessus pour les fémurs, en coupant au niveau de l’articulation de la hanche comme le tibia a été coupé au niveau de l’articulation de la cheville. Utilisez le même tube de 50 mL pour prélever le milieu de culture BMDM pendant que la moelle est rincée.
8. Une fois que les quatre os ont été rincés, aspirez la moelle et le milieu du tube de 50 ml de haut en bas 3 fois à travers une aiguille de 18 g sur une seringue de 10 ml, en rinçant les côtés du tube à chaque fois pour disperser la moelle.
9. Ajustez le volume final du tube de 50 mL à 30 mL avec un milieu de culture BMDM et assurez-vous que les cellules sont bien suspendues.
10. À l’aide d’une passoire cellulaire de 70 μm, filtrez le milieu de culture BMDM du tube de 50 mL.
11. Placez la suspension cellulaire résultante, qui contient les cellules progénitrices de la moelle osseuse, dans trois boîtes de culture tissulaire de 150 mm en ajoutant 10 ml (ou ~20 × 10⁶ cellules) à chacune. Ensuite, ajoutez 10 ml de milieu de culture BMDM dans chaque boîte. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C.

3. Différenciation des BMDM et placage pour les expériences

1. Incuber les cellules progénitrices de la moelle osseuse en plaque à 37 °C pendant 3 jours. Ensuite, retirer chaque plat et ajouter 5 à 8 ml de milieu de culture BMDM (tableau 1). Remettre dans l’incubateur à 37 °C.
2. Le 5e jour après le placage initial, retirer chaque plat et ajouter 5 ml supplémentaires de milieu de culture BMDM. Remettre dans l’incubateur à 37 °C.
3. Le jour 6, retirez chaque plat et jetez le support. Ensuite, ajoutez 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide (conservée à 4 °C) pour laver une fois. Jetez les 10 ml de savon PBS froid. Ensuite, ajoutez 10 ml de PBS frais et froid dans chaque plat et incubez chaque plat sur de la glace pendant 5 min.
4. À l’aide d’un grattoir à cellules, grattez doucement les cellules des trois boîtes dans un tube de 50 ml. Faites tourner doucement les cellules à 270 × g à 4 °C pendant 5 min. Ensuite, jetez le surnageant.
5. Ajouter 20 mL de milieu de culture BMDM, pipeter de haut en bas pour remettre la pastille en suspension et compter les cellules.
   note: On s’attend à ce que chaque souris produise environ 60 × 10 6-100 × 10⁶ cellules.
6. Planifiez la disposition des plaques à 12 puits pour le test de stimulation in vitro de la mort cellulaire/inflammation souhaité. Prévoyez de plaquer 1 × 10⁶ cellules par puits. Pour chaque stimulation prévue, inclure au moins trois répétitions biologiques et placer un ensemble de puits à récolter dans le tampon de lyse de caspase et un deuxième ensemble de puits à récolter dans le tampon RIPA.
7. Plaque 1 × 10⁶ cellules dans 1 mL de milieu de culture BMDM par puits dans des plaques de 12 puits. Cultiver toute la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C avant de procéder à l’évaluation de la mort cellulaire/inflammation. Après une nuit d’incubation, retirer le milieu et ajouter 1 mL de PBS chaud (37 °C) dans chaque puits pour laver les cellules.
8. Retirer le lavage PBS et ajouter 500 μL de milieux de stimulation BMDM avec des antibiotiques (si vous effectuez des stimulations non bactériennes) ou des milieux de stimulation BMDM sans antibiotiques (si vous effectuez des stimulations bactériennes) (Tableau 1). Incuber pendant 2 h avant de passer à l’étape 4 pour la stimulation/infection in vitro.

4. Stimuler ou infecter les cellules

ATTENTION : Les agents inclus dans ce protocole sont potentiellement pathogènes et doivent être manipulés avec les précautions appropriées dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL2) avec l’approbation des autorités institutionnelles et gouvernementales compétentes.

1. Stimuler les BMDM pour activer la mort cellulaire avec le déclencheur d’intérêt.
   note: Aux fins de ce protocole, le virus de la grippe A (IAV), le virus de l’herpès simplex 1 (HSV1), Francisella novicida et LPS + ATP sont utilisés à titre d’illustration, mais d’autres déclencheurs peuvent être utilisés.
   1. Exemple de stimulation 1 : Infecter avec l’IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (construit selon Hoffmann et al. ; le titre viral pour la détermination de la multiplicité de l’infection [MOI] est calculé par un test de plaque dans les cellules MDCK) :
      1. Calculer le volume de virus nécessaire à l’infection à une multiplicité d’infection (MOI) de 20 unités formant des plaques (PFU) à l’aide de l’équation (1) et de l’équation (2) :
         5. Collecte du surnageant et du lysat de protéine combinés à utiliser pour les transferts western de caspase
         1. Après 4 h, 12 h ou 16 h d’incubation (le moment spécifique dépend de la gâchette utilisée), retirez la plaque de l’incubateur.
         2. Prélever 150 μL du surnageant ; le jeter ou le conserver pour d’autres analyses de surnageant (p. ex., dosage immuno-enzymatique [ELISA]). Ne retirez pas le surnageant restant.
         3. Créez la solution de collecte des protéines en combinant 50 μL de tampon de lyse de caspase + 100 μL de 4 tampons SDS par puits (Tableau 1). Ensuite, ajoutez 150 μL du mélange dans chaque puits.
         4. Pour chaque puits, pipetez le mélange de haut en bas pour recueillir les cellules lysées et le surnageant. Pendant le pipetage, grattez également le fond du puits avec la pointe de la pipette pour perturber les cellules. Après le grattage et le pipetage, recueillir le lysat de protéines dans des tubes de 1,5 ml marqués.
         5. À l’aide d’un bloc de chaleur, chauffer tous les tubes à 100 °C pendant 12 min.
         6. Granuler tous les composants insolubles par centrifugation à 14 500 × g pendant 30 s à température ambiante.
            REMARQUE : Il s’agit d’un point de pause - la protéine du surnageant et des lysats de protéines combinés peut être utilisée immédiatement ou stockée à -20 °C jusqu’à 2 mois ou à -80 °C jusqu’à 6 mois jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.

         catégorie	Réactifs	préparation	Remarques	Précautions de sécurité
         Média	Milieux de culture L929	1) Chaleur inactivant FBS (voir remarques). 2) Combinez 43,5 ml de milieu Dulbecco's modifié (IMDM) d'Iscove, 5 ml de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (HI-FBS), 0,5 ml de pyruvate de sodium, 0,5 ml d'acides aminés non essentiels et 0,5 ml de pénicilline et de streptomycine.	Inactiver thermiquement le FBS en l’incubant à 56 °C pendant 30 min.
         	Milieux de culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM)	Combinez 290 ml d’IMDM, 150 ml de milieu conditionné au L929 et 5 ml d’acides aminés non essentiels, 50 ml de HI-FBS et 5 ml de pénicilline et de streptomycine.	Réchauffez le support à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation. Les supports peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 semaine maximum.
         	Milieux de stimulation de la BMDM avec antibiotiques	Combinez 445 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml de HI-FBS et 5 ml de pénicilline et de streptomycine.	Réchauffez le support à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation. Les supports peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 semaine maximum.
         	Milieux de stimulation de la DMO sans antibiotiques	Combinez 450 ml de DMEM et 50 ml de HI-FBS.	Réchauffez le support à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation. Les supports peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 semaine maximum.
         	Milieux pour l’infection (pas de HI-FBS)	Combinez 495 ml de DMEM à haute teneur en glucose avec 5 ml de pénicilline et de streptomycine.	Réchauffez le support à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation. Les supports peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 semaine maximum.
         Tampon de dodécylsulfate de sodium (SDS)	1 M de tampon Tris (pour 4x tampon SDS)	1) Dissoudre 12,11 g de Tris dans 80 mL d’eau désionisée. 2) Ajustez le pH à 6,8 en ajoutant des gouttes de HCl tout en remuant. 3) Ajouter de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 100 ml.	La mémoire tampon peut être stockée à 4 °C jusqu’à 1 mois.	HCl est caustique. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants. Le HCl doit être manipulé dans une hotte.
         	4x tampon SDS	1) Combinez 60 ml de solution de 1 M de Tris (pH 6,8), 24 mg de SDS, 100 mg de bleu de bromophénol, 120 ml de glycérol, 8,4 ml de β-mercaptoéthanol (BME) et 90 ml d’eau déminéralisée. 2) Agitez sur une plaque d’agitation chauffante pour permettre aux sels d’entrer dans la solution. 3) Ajouter de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 300 ml.	Le tampon peut être aliquote et stocké à -20 °C jusqu’à 1 an.	Le SDS est caustique et le BME est cancérigène. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants. Les FDS et BME doivent être manipulés dans une hotte.
         Tampon de lyse de caspase	1 M 1,4-dithiothréitol (DTT)	Dissoudre 0,154 g de poudre de DTT dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laissez la TNT entrer dans la solution.	Le tampon peut être aliquote en aliquotes de 200 μL et stocké à -20 °C jusqu’à 1 an.
         	Tampon de lyse de caspase	Combinez 35 ml d’eau désionisée, 4 ml de NP-40, 750 μL de 1 M DTT, 1 comprimé inhibiteur de protéase et 1 comprimé inhibiteur de phosphatase.	La mémoire tampon peut être stockée à 4 °C jusqu’à 1 mois.
         tampon d’essai de radio-immunoprécipitation (RIPA)	1,5 M tampon Tris (pour tampon RIPA)	1) Dissoudre 18,2 g de Tris dans 80 mL d’eau déminéralisée. 2) Ajustez le pH à 8,8 en ajoutant des gouttes de NaOH tout en remuant. 3) Ajouter de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 100 ml.	La mémoire tampon peut être stockée à 4 °C jusqu’à 1 mois.	Le NaOH est corrosif et peut provoquer des brûlures. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants.
         	10 % (poids/vol) FDS solution (pour tampon RIPA)	1) Ajouter 10 g de FDS à 80 mL d’eau déminéralisée. 2) Remuer jusqu’à dissolution. 3) Ajouter de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 100 ml.	La solution peut être conservée à température ambiante jusqu’à 6 mois. Si la solution précipite, chauffer doucement pour la dissoudre à nouveau.	Le SDS est caustique. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants. Les FDS doivent être manipulées dans une hotte.
         	Tampon RIPA (2x stock)	1) Combinez 0,5 g de désoxycholate de sodium, 1 mL de NP-40, 0,876 g de NaCl, 3,3 mL de 1,5 M Tris (pH 8,8) et 1 mL de 10 % (poids/vol) de SDS dans 46 mL d’eau déminéralisée. 2) Remuer jusqu’à dissolution. 3) Ajouter de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 50 ml.	2x stock RIPA peut être stocké à 4 °C jusqu’à 1 mois.	Le SDS est caustique. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants. Les FDS doivent être manipulées dans une hotte.
         Déclencheurs stériles	Lps	Dissoudre le LPS lyophilisé d’E. coli 0111 :B4 dans de l’eau exempte d’endotoxines à une concentration de 5 mg/mL.	La solution peut être conservée à -20 °C jusqu’à 2 ans.
         	0,5 M ATP	Dissoudre 1 g d’ATP lyophilisé dans 3,63 mL d’eau exempte d’endotoxines.	La solution peut être aliquote et stockée à −20 °C jusqu’à 2 ans.
         Western solutions de transfert	Exécution du buffer (5x stock)	1) Combinez 15 g de base Tris, 72 g de glycine et 5 g de SDS dans 900 ml d’eau déminéralisée. 2) Remuez jusqu’à ce qu’il ne reste plus de particules. 3) Ajoutez de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 1 L.	Le tampon peut être conservé à température ambiante jusqu’à 6 mois.	Le SDS est caustique. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants. Les FDS doivent être manipulées dans une hotte.
         	Tampon de transfert (10x stock)	1) Combinez 30,3 g de base Tris et 72 g de glycine dans 900 mL d’eau déminéralisée. 2) Remuez jusqu’à ce qu’il ne reste plus de particules. 3) Ajoutez de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 1 L.	Le tampon peut être stocké à température ambiante jusqu’à 3 mois.
         	Solution saline tamponnée au tris avec Tween 20 (TBST)	1) Dissoudre 2,42 g de base Tris et 8,76 g de NaCl dans 850 mL d’eau désionisée><. 2) Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant des gouttes de HCl tout en remuant. 3) Ajouter de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 1 L. 4) Ajouter 0,5 mL de Tween 20 (concentration finale de 0,05 % (vol/vol)).	La solution peut être conservée à température ambiante pendant 1 mois.	HCl est caustique. Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié ; Cela comprendra une blouse de laboratoire et des gants. Le HCl doit être manipulé dans une hotte.
         	Solution de blocage du lait écrémé à 5 % (poids/vol)	Dissoudre 5 g de lait écrémé en poudre dans 100 mL de TBST.	La solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
         Anticorps primaires	Anticorps primaire contre la caspase-1	Diluer l’anticorps anti-caspase-1 1:1 000 (vol/vol) en ajoutant 10 μL de l’anticorps à 10 mL de solution bloquante de lait écrémé à 5 % (poids/vol).	Pour des résultats optimaux, faites du frais pour chaque expérience. Cependant, cette solution peut être utilisée au moins 3 fois sans perte d’efficacité. Conserver à -20 °C en cas de réutilisation.
         	Anticorps primaire de la caspase-11	Diluer l’anticorps anti-caspase-11 1:1 000 (vol/vol) en ajoutant 10 μL de l’anticorps à 10 mL de solution bloquante de lait écrémé à 5 % (poids/vol).	Pour des résultats optimaux, faites du frais pour chaque expérience. Cependant, cette solution peut être utilisée au moins 3 fois sans perte d’efficacité. Conserver à -20 °C en cas de réutilisation.
         	Anticorps primaire de la caspase-3	Diluer l’anticorps anti-caspase-3 et l’anticorps anti-caspase-3 clivé 1:1 000 (vol/vol) en ajoutant 10 μL de chaque anticorps à la même solution de blocage du lait écrémé à 10 mL à 5 % (poids/vol).	Pour des résultats optimaux, faites du frais pour chaque expérience. Cependant, cette solution peut être utilisée au moins 3 fois sans perte d’efficacité. Conserver à -20 °C en cas de réutilisation.
         	Anticorps primaire de la caspase-7	Diluer l’anticorps anti-caspase-7 et l’anticorps anti-caspase-7 clivé 1:1 000 (vol/vol) en ajoutant 10 μL de chaque anticorps à la même solution de blocage du lait écrémé à 10 mL à 5 % (poids/vol).	Pour des résultats optimaux, faites du frais pour chaque expérience. Cependant, cette solution peut être utilisée au moins 3 fois sans perte d’efficacité. Conserver à -20 °C en cas de réutilisation.
         	Anticorps primaire contre la caspase-8	Diluer l’anticorps anti-caspase-8 et l’anticorps anti-caspase-8 clivé 1:1 000 (vol/vol) en ajoutant 10 μL de chaque anticorps à la même solution de blocage du lait écrémé à 10 mL à 5 % (poids/vol).	Pour des résultats optimaux, faites du frais pour chaque expérience. Cependant, cette solution peut être utilisée au moins 3 fois sans perte d’efficacité. Conserver à -20 °C en cas de réutilisation.
         	Anticorps primaire de la caspase-9	Diluer l’anticorps anti-caspase-9 1:1 000 (vol/vol) en ajoutant 10 μL de l’anticorps à 10 mL de solution bloquante de lait écrémé à 5 % (poids/vol).	Pour des résultats optimaux, faites du frais pour chaque expérience. Cependant, cette solution peut être utilisée au moins 3 fois sans perte d’efficacité. Conserver à -20 °C en cas de réutilisation.
         	Anticorps primaire β-actine conjugué à HRP	Diluer l’anticorps anti-β-actine 1:5 000 (vol/vol) en ajoutant 2 μL de l’anticorps à 10 mL de solution bloquant le lait écrémé à 5 % (poids/vol).	Cet anticorps doit être préparé frais pour chaque expérience.
         Anticorps secondaires	Anticorps anti-lapin	Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) 1:5 000 (vol :vol) en ajoutant 2 μL de l’anticorps à 10 ml de solution bloquant le lait écrémé à 5 % (poids/vol).	La dilution de l’anticorps doit être préparée fraîche à chaque fois.
         	Anticorps anti-souris	Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la HRP 1:5 000 (vol :vol) en ajoutant 2 μL de l’anticorps à 10 ml de solution bloquant le lait écrémé à 5 % (poids/vol).	La dilution de l’anticorps doit être préparée fraîche à chaque fois.
         	Anticorps anti-rat	Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la HRP 1:5 000 (vol :vol) en ajoutant 2 μL de l’anticorps à 10 ml de solution bloquant le lait écrémé à 5 % (poids/vol).	La dilution de l’anticorps doit être préparée fraîche à chaque fois.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre 0,45 μm	Millipore	SCHVU05RE
Seringue de 10 mL	BD Biosciences	309604
Plaque à 12 puits	Corning	Tél. : 07-200-82
Aiguille 18 G	BD Biosciences	305195
Aiguille de 25 g	BD Biosciences	305122
Tube de 50 mL	Fisher Scientific	Tél. : 50-809-218
Crépine à cellules de 70 μm	Corning	431751
Boîtes de culture tissulaire de 150 mm	Corning	430597
Fiole de culture tissulaire de 182 cm2	Genesee Scientific	25 à 211
ATP	InvivoGen	tlrl-atpl
BBL Trypticase Bouillon de Soja	BD Biosciences	211768
Bain de billes	Chemglass Sciences de la vie	Référence : CLS-4598-009
Biophotomètre D30	Eppendorf	6133000010
Racleurs de cellules	Produits scientifiques CellTreat	229315
Chambre à CO2	VetEquip	901703
Cuvettes	Fisher Scientific	Tél. : 14-955-129
Ciseaux de dissection	Thermo Fisher Scientific	LES 221S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	Référence 11995-073
éthanol	Pharmco	111000200
Sérum fœtal bovin	Biowest	S1620
Papier filtre	Bio-Rad	1703965
forceps	Fisher Scientific	Référence 22-327379
Francisella novicida (souche U112)	Ressources BEI	NR-13
La gentamycine	Gibco	15750060
Bloc de chaleur	Fisher Scientific	Référence : 23-043-160
Virus de l’herpès simplex 1 (souche HF)	ATCC	VR-260
DMEM à haute teneur en glucose	sigma	Réf. D6171
Incubateur humidifié	Thermo Fisher Scientific	51026282
IMDM	Thermo Fisher Scientific	Référence 12440-053
Virus de la grippe A (A/Porto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	construit par Hoffmann et al.
Cellules L929	ATCC	CCL-1	Lignée cellulaire pour la création de milieux conditionnés L929
L-cystéine	Thermo Fisher Scientific	BP376-100
Cellules MDCK	ATCC	CCL-34	Lignée cellulaire pour déterminer le titre viral de l’IAV
Microcentrifugeuse	Thermo Fisher Scientific	75002401
Acides aminés non essentiels	Gibco	11140050
La solution NP-40	sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Scientific	10010023
Pénicilline et streptomycine	sigma	Réf. P4333
Pétri	Fisher Scientific	Référence : 07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Source d’alimentation	Bio-Rad	Référence 164-5052
Comprimé inhibiteur de protéase	sigma	S8820
hydroxyde de sodium	sigma	Référence 72068
Pyruvate de sodium	Gibco	Référence 11360-070
Boîte de Pétri carrée	Fisher Scientific	FB0875711A
Centrifugeuse de table	Thermo Fisher Scientific	75004524
Lipopolysaccharide ultrapur (LPS) d’E. coli 0111 :B4	InvivoGen	TLRL-3PELPS
Cellules Vero	ATCC	CCL-81	Lignée cellulaire pour la détermination du titre viral du HSV1