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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Analyse des cytokines lacrymales
- Collecte de larmes :
- Demandez au sujet de s’asseoir confortablement sur une chaise d’examen et de placer sa tête contre l’appui-tête.
- Demandez au sujet de lever les yeux, ouvrez soigneusement les bandes Schirmer (en papier filtre Whatman n° 41), placez l’extrémité arrondie de la bande sur le fornix inférieur de l’œil et demandez au sujet de fermer les yeux pendant 5 minutes. Lors de la collecte des larmes, prenez grand soin de minimiser le contact avec la surface oculaire.
- Demandez au sujet d’ouvrir les yeux pour retirer la bandelette et de la placer dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml. Transférez immédiatement le tube au laboratoire ou conservez-le à -80 °C jusqu’à ce que le profilage des cytokines soit effectué.
- Élution de l’échantillon lacrymal de la bande lacrymale :
- Coupez la bande lacrymale à une longueur de 0,5 cm (pour standardiser la quantité de larmes à tester) et placez-la dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml.
- Ajouter 30 μL de tampon de dosage et incuber à température ambiante pendant 5 min, puis centrifuger le tube à 14 000 x g pendant 1 min.
- Transférez le surnageant dans un autre tube de microcentrifugation de 1,5 mL et jetez la bandelette. Placez l’échantillon contenant le tube sur de la glace et utilisez immédiatement l’échantillon lacrymal élué pour le profilage des cytokines.
- Préparation des réactifs :
REMARQUE : Les quarante et un analytes à tester dans chaque échantillon par dosage multiplex à base de billes sont l’interleukine (IL)-1α, l’IL-1β, l’IL-Rα, l’IL-2, l’IL-3, l’IL-4, l’IL-5, l’IL-6, l’IL-7, l’IL-8, l’IL-9, l’IL-10, l’IL-12 p40, l’IL-12 p70, l’IL-13, l’IL-15, l’IL-17A, l’interféron alpha (IFN-α) 2, l’IFN-γ, la protéine inductible par l’IFN-gamma 10 (IP-10, CXCL10), la chimiokine dérivée des macrophages (MDC), Protéine inflammatoire des macrophages (MIP)-1α et MIP-1β, protéine chimiotactique des monocytes (MCP)-1, MCP-3, facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), TNF-β, oncogène régulé par la croissance (GRO), facteur de croissance tumorale alpha (TGF-α), facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance des fibroblastes (FGF)-2, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), éotaxine, fractalkine, ligand CD40 soluble (sCD40L), ligand tyrosine kinase 3 de type Fms (Flt-3L) et régulé lors de l’activation, protéine normale exprimée et sécrétée par les lymphocytes T (RANTES).
- Amener les flacons de solution de billes d’anticorps (50X) à température ambiante (20 à 25 °C) et agiter les flacons pendant 1 min.
- Comptez le nombre de puits requis pour l’essai et calculez la quantité totale de solution de cocktail de billes d’anticorps (25 μL par puits) et de chaque solution de billes d’anticorps (50X) requise pour l’essai.
- Préparez la solution cocktail en ajoutant la quantité calculée de chaque solution de billes d’anticorps et remplissez-la jusqu’au volume final souhaité en ajoutant la quantité restante de diluant pour billes. Assurez-vous que la concentration finale de chaque anticorps dans le cocktail est de 1X. Préparez toujours au moins 20 % de volume supplémentaire de solution cocktail en cas d’erreur de pipetage.
note: À titre d’exemple, pour un test à 96 puits, préparez 3000 μL de solution de cocktail de billes d’anticorps. La quantité requise de chaque solution de billes d’anticorps = 3000/concentration de stock de chaque solution de billes d’anticorps ; 3000/50 = 60 μL de chaque solution de billes d’anticorps
- Ajouter 60 μL de chacune des 41 solutions de billes d’anticorps (60 X 41 = 2460 μL) dans une bouteille cocktail et ajouter 540 μL de solution de diluant de billes au mélange de billes d’anticorps pour obtenir 3000 μL de solution de travail finale (1X).
- Avant utilisation, mélangez correctement la solution de cocktail de billes. Après le test, conservez le volume restant à 2-8 °C jusqu’à 30 jours.
- Préparez les contrôles de qualité (CQ) en ajoutant 250 μL d’eau désionisée aux stocks de QC 1 et QC 2.
- Mélangez correctement en retournant les bouteilles plusieurs fois et en tourbillonnant pendant 10 secondes. Transférez la solution dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène correctement étiquetés et conservez le reste de la solution à -20 °C, ce qui peut être utilisé jusqu’à 30 jours.
- Préparez le tampon de lavage en ajoutant 270 ml d’eau déminéralisée à 30 ml de solution de tampon de lavage 10X et mélangez bien (avant la dilution, amenez le tampon 10X à température ambiante et dissolvez tous les précipités de sel en mélangeant). Conservez le tampon de lavage inutilisé (1X) à 2-8 oC qui peut être utilisé jusqu’à 30 jours.
- Préparez le stock étalon de cytokines humaines (10 000 pg/mL de tous les analytes) en ajoutant 250 μL d’eau désionisée dans le flacon standard. Bien mélanger en retournant plusieurs fois et en faisant tourbillonner le flacon pendant 10 secondes. Laisser reposer pendant 10 minutes et transférer la solution mère dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène correctement étiquetés. Après le dosage, conservez le reste de la solution à -20 °C, ce qui peut être utilisé jusqu’à 30 jours.
- Préparez les étalons de cytokines humaines fonctionnels par dilutions en série de 5 fois (50 μL -> 200 μL) avec un tampon de dosage pour obtenir 2000, 400, 80, 16 et 3,2 pg/mL.
- Après la préparation de l’étalon, utiliser les étalons de travail dans les 60 minutes et utiliser le tampon d’essai comme blanc/fond (-pg/mL).
- Profilage des cytokines par dosage multiplex à base de billes :
- Amenez tous les réactifs à température ambiante et au vortex pendant 5 à 10 secondes avant de les ajouter à la plaque de microtitration à 96 puits. Si les échantillons de larmes éluées sont entreposés à -80 °C avant le dosage, décongelez les extraits lacrymaux congelés sur de la glace et centrifugez-les à 1000 X g pendant 5 min.
- Préparez une feuille de travail de test en configuration verticale pour les étalons de cytokines humaines de travail [0 (blanc), 3.2, 16, 80, 400, 2 000 et 10 000 pg/mL], QC1, QC2 et les échantillons.
- Ajoutez 200 μL de tampon de lavage 1X dans chaque puits de la plaque, scellez-la avec une scelleuse de plaques et conservez-la sur un agitateur de plaque à température ambiante (20-25 °C) pendant 10 min.
- Décantez le tampon de lavage 1X en inversant la plaque et en la collant plusieurs fois sur des serviettes absorbantes pour éliminer toute quantité résiduelle de tampon de lavage dans les puits.
- Ajouter 25 μL de chaque étalon de cytokines humaines en état de fonctionnement, QC1, QC2, blanc (tampon de dosage) et des échantillons dans les puits appropriés.
- Ajouter 25 μL de tampon de dosage dans chaque puits.
- Ajouter 25 μL de solution cocktail de billes d’anticorps 1X dans chaque puits. Comme la solution de billes d’anticorps est sensible à la lumière, scellez la plaque avec une scelleuse de plaque et couvrez-la d’une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière pendant le test.
- Incuber l’assiette à 4 °C pendant la nuit sur un shaker.
- Placez la plaque sur le support à plaques d’un lave-plaques magnétique automatique. Laissez reposer 1 minute pour déposer les billes magnétiques au fond du puits et aspirer le contenu du puits. Ajoutez 200 μL de tampon de lavage par puits, laissez reposer pendant 1 min, puis aspirez le contenu du puits. Répétez le lavage une fois de plus (pour le lavage des plaques, suivez les instructions du fabricant du kit).
- Ajouter 25 μL de solution d’anticorps de détection dans chaque puits, sceller la plaque, la recouvrir de papier d’aluminium et incuber à température ambiante pendant 60 min sur un agitateur.
- Ajoutez 25 μL de solution de streptavidine-phycoérythrine dans chaque puits, scellez la plaque, couvrez-la de papier d’aluminium et incubez à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur.
- Placez la plaque sur une rondelle de plaque magnétique. Laissez reposer pendant 1 minute, puis aspirez le contenu du puits. Ajouter 200 μL de tampon de lavage par puits. Laissez reposer pendant 1 minute, puis aspirez le contenu du puits. Répétez le lavage une fois de plus.
- Ajouter 150 μL de liquide de gaine dans chaque puits et placer la plaque sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante pour remettre en suspension les billes d’anticorps.
- Lisez immédiatement la plaque à l’aide du lecteur de plaques de test multiplex à base de billes et analysez les concentrations de cytokines à l’aide d’un algorithme d’ajustement de courbe à 5 paramètres. La figure 1 présente un schéma de schéma du profilage des cytokines lacrymales.
- Lecture de la plaque de dosage (mise en place de l’instrument) et analyse des données :
- Allumez le lecteur de test multiplex à base de billes et préchauffez le laser pendant 30 min.
- Lancez le logiciel de dosage multiplex basé sur des billes. Sous l'onglet « Maintenance automatisée », sélectionnez l'option « Calibration-vérification ». Vortex chaque flacon de réactif des billes d’étalonnage et de vérification pendant 30 secondes. Placez 5 gouttes de chaque réactif dans les puits désignés. Remplissez les réservoirs désignés avec de l’eau déminéralisée et de l’éthanol à 70 %.
