Utilisation de l’hybridation in situ par fluorescence immuno-ARN pour visualiser le SRAS-CoV-2

1. ARN-FISH du SARS-CoV-2 dans les cellules Vero cultivées sur lamelles

JOUR 1

1. Cellules de fixation et de perméabilisation
   1. Fixer les cellules infectées avec une solution de PFA à 3,7 % p/v pendant 1 h à RT.
   2. Aspirez la solution PFA à 3,7 % et lavez les cellules deux fois à l’aide de 1 PBS.
   3. Perméabiliser les cellules avec une solution de PBST pendant 10 min à RT avec agitation.
   4. Aspirez le PBST et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
2. détection
   1. Aspirez la solution 1x PBS et lavez les cellules deux fois avec 2x SSC à RT.
   2. Aspirez la solution SSC 2x et préhybridez les échantillons en ajoutant au moins 300 μL de tampon d’hybridation de sonde. Couvrez les puits contenant les cellules et incubez à 37 °C pendant 30 min.
   3. Préparez la solution de sonde en ajoutant 1,2 pmol de mélange de sonde au tampon d’hybridation de la sonde.
      1. Utilisez 1,2 μL de la sonde de 1 μM pour préparer 300 μL de matériel de travail.
   4. Retirez la solution de préhybridation et transférez les lamelles dans une chambre humidifiée.
      1. Pipeter 30 à 50 μL de solution de sonde sur du parafilm pour former des gouttelettes individuelles.
   5. Incuber les échantillons pendant la nuit (12-18 h) à 37 °C.

JOUR 2

1. Transférez les lamelles dans une plaque à 12 puits et éliminez l’excès de solution de sonde en lavant pendant 4 x 5 min avec 400 μL de tampon de lavage de sonde à 37 °C
   note: Au lieu de placer des aliquotes de 30 à 50 μl sur le parafilm et sous les lamelles pour l’incubation, ajoutez 300 μL de solution de sonde directement sur les lamelles dans une plaque à 12 puits. Cette procédure est plus simple mais nécessite des quantités substantielles de réactifs. Chauffez le tampon de lavage de la sonde à 37 °C avant utilisation. Calculez la quantité de tampon nécessaire et transférez-la dans un tube à centrifuger conique de 15 ml.
2. Laver les échantillons pendant 2 x 5 min avec 5x SSCT à RT.
3. Remplacez la solution SSCT 5x par 1x PBS et stockez les échantillons à 4 °C jusqu’à l’amplification.

3. Amplification

1. Retirez la 1x solution PBS des puits et ajoutez au moins 300 μL de tampon d’amplification dans chaque puits. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à RT.
2. Préparez chaque épingle à cheveux HCR (h1 et h2) en refroidissant par enclenchement le volume souhaité dans des tubes séparés.
   1. Pour préparer 300 μL de solution d’amplification, utilisez 18 μL de chaque épingle à cheveux (p. ex., pour 300 μL, utilisez 6 μL d’une solution mère d’épingle à cheveux de 3 μM).
   2. Transférez la solution d’épingle à cheveux dans des tubes.
   3. Incuber à 95 °C pendant 90 s.
   4. Laisser refroidir à RT pendant 30 min dans l’obscurité.
3. Préparez un mélange d’épingles à cheveux en ajoutant les épingles à cheveux « h1 » et « h2 » refroidies par pression au tampon d’amplification.
4. Déposer des gouttes de 30 à 50 μL de mélange d’épingle à cheveux sur le parafilm.
5. Incuber les échantillons pendant la nuit (12-18 h) dans l’obscurité à RT.

JOUR 3

6. Transférez les lamelles dans la plaque à 12 puits et retirez l’excédent d’épingles à cheveux en lavant pendant 5 x 5 min avec 5x SSCT à RT avec agitation.
7. Aspirez la mémoire tampon SSCT 5x et remplacez-la par 1x PBS.
   note: Si nécessaire, utilisez les échantillons ARN-FISH dans un test d’immunofluorescence standard, suivi d’une coloration des noyaux (voir rubrique 1.4).

4. Coloration nucléaire et montage sur glissière

1. Aspirer la solution 1x PBS et la remplacer par 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 0,2 μg/mL) dans 1x solution PBS.
2. Incuber les échantillons pendant 10 min à RT dans l’obscurité.
3. Aspirez la solution DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
4. Placez deux gouttes de 10 μL chacune de support de montage ; assurez-vous que les gouttes sont suffisamment séparées pour permettre de placer deux lamelles sur une seule lame.
5. Retirez l’excès de liquide en tapotant les lamelles sur une serviette propre, puis placez-les dans un support de montage anti-décoloration avec les cellules vers le bas.
6. Placez les échantillons montés sur une surface sèche et plane dans l’obscurité et laissez-les durcir.
7. Après le durcissement, scellez les bords des lamelles avec du mastic VALAP ou du vernis à ongles pour éviter que les échantillons ne se dessèchent.

2. ARN-FISH du SARS-CoV-2 dans les cultures d’AOH

JOUR 1

1. Fixer et perméabiliser la culture de l’AOH
   1. Aspirez le milieu et fixez les cellules infectées à l’aide d’une solution de PFA à 3,7 % pendant 1 h à RT.
   2. Aspirez la solution PFA à 3,7 % et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
      1. Remplacez la solution de PFA à 3,7 % par 1x PBS sous un insert Transwell.
   3. Jetez le PBS et déshydratez les échantillons à l’aide de 2 lavages de 5 minutes avec 100 % de MeOH pré-refroidi à -20 °C.
   4. Après le deuxième lavage, remplacez le tampon par du MeOH frais et réfrigéré pour la perméabilisation sous l’insert Transwell. Conserver une nuit à -20 °C.

JOUR 2

2. Réhydratation
   Réhydratez les échantillons à l’aide d’une série graduée de solutions MeOH/PBST (chacune pendant 5 min) sur glace : 75 % MeOH/25 % PBST, 50 % MeOH/50 % PBST, 25 % MeOH/75 % PBTS et 100 % PBST (deux fois).
   1. Lavez les cellules pendant 5 min sur de la glace avec 50 % 5x SSCT/50 % PBST.
   2. Laver les cellules pendant 5 min sur de la glace avec 5x SSCT.
   3. Remplacez le tampon SSCT 5x par 1x PBS.
3. détection
   1. Incuber les cellules (à l’intérieur de l’insert Transwell) pendant 5 min sur de la glace avec 100 μL de tampon d’hybridation de sonde. Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur pendant 30 minutes à 37 °C (préhybridation).
      note: Le tampon d’hybridation de la sonde doit être préchauffé à 37 °C avant utilisation. Calculez le volume requis : 100 μL sont nécessaires pour un seul insert Transwell.
   2. Préparez la solution de sonde. Comme 1 mL de solution de sonde nécessite 4 pmol de sonde, ajouter 4 μL de solution mère de sonde 1 μM à 1 mL de tampon d’hybridation de sonde et bien mélanger.
      note: Pour la détection de l’ARN, utilisez 100 μL de solution de sonde par insert Transwell. Laisser la solution de sonde sur la glace jusqu’à la fin de l’étape de préhybridation.
   3. Retirez la solution de préhybridation et ajoutez la solution de sonde.
   4. Incuber les cellules pendant la nuit (12-18 h) à 37 °C.

JOUR 3

5. Éliminer l’excédent de sonde en lavant pendant 4 x 15 min avec 100 μL de tampon de lavage de sonde à 37 °C.
6. Laver les échantillons pendant 2 x 5 min avec 5x SSCT à RT.
7. Remplacez le SSCT 5x par 1x PBS et stockez les échantillons à 4 °C jusqu’à l’amplification.

4. amplification

1. Préamplifier les échantillons en les incubant avec un tampon d’amplification pendant 30 min à RT.
2. Préparez chaque épingle à cheveux en refroidissant les volumes souhaités dans des tubes séparés.
   1. Pour préparer 500 μL de solution d’amplification, utilisez 30 pmol de chaque épingle à cheveux (p. ex., pour 500 μL, utilisez 10 μL de solution mère d’épingle à cheveux 3 μM).
   2. Transférez la solution d’épingle à cheveux dans les tubes.
   3. Incuber à 95 °C pendant 90 s.
   4. Laisser refroidir à RT pendant 30 min dans l’obscurité.
3. Préparez la solution d’épingle à cheveux en ajoutant toutes les épingles à cheveux refroidies par pression à 500 μL de tampon d’amplification à RT.
4. Retirez la solution de préamplification et ajoutez la solution complète en épingle à cheveux.
5. Incuber les échantillons pendant la nuit (12-18 h) à RT dans l’obscurité.
6. Retirez l’excès d’épingles à cheveux en lavant avec 5x SSCT à RT comme suit : 2 x 5 min, 2 x 15 min et 1 x 5 min.
7. Remplacez la solution 5x SSCT par 1x PBS, et stockez-la à 4 °C pendant 2-3 jours au maximum, ou procédez directement à la coloration nucléaire.
   note: Si nécessaire, utilisez les échantillons d’ARN-FISH dans un test d’immunofluorescence standard, suivi d’une coloration nucléaire (voir rubrique 3).

5. Coloration nucléaire et montage sur glissière

1. Aspirez la solution 1x PBS et remplacez-la par une solution DAPI (0,2 μg/mL) dans 1x PBS.
2. Incuber les échantillons pendant 10 min à RT dans l’obscurité.
3. Aspirez la solution DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
4. Placez la membrane découpée des inserts Transwell sur 10 μL de milieu de montage anti-évanouissement avec les cellules vers le haut, et ajoutez un produit de montage supplémentaire (5 μL) à la membrane.
5. Recouvrez les membranes avec des lamelles.
6. Durcissez les échantillons montés sur une surface sèche et plane dans l’obscurité.
7. Après le durcissement, scellez les bords des lamelles avec du mastic VALAP ou du vernis à ongles pour éviter que les échantillons ne se dessèchent.

3. Analyse par immunofluorescence de cellules Vero et de cultures d’AOH

REMARQUE : Effectuer le test d’immunofluorescence le jour 3 pour les lignées cellulaires ou le jour 4 pour les cultures d’AOH. Utilisez une approche différente pour chaque modèle. Toutes les différences sont clairement indiquées.

1. Aspirez la solution 1x PBS des puits.
2. Bloquer les échantillons par incubation avec de l’albumine sérique bovine à 1 % p/v dans une solution de PBST pendant 30 min à 37 °C.
3. Préparez les anticorps primaires en préparant des dilutions appropriées dans une solution bloquante et incuberez.
   1. Pour les cellules Vero sur les lamelles :
      1. Placez des gouttes (30-50 μL) de solution d’anticorps sur du parafilm dans une chambre d’humidité.
      2. Placez les lamelles sur les gouttes d’anticorps avec les cellules vers le bas.
   2. En cas d’AOH, remplacer l’agent bloquant dans les inserts par une solution d’anticorps (100 μL) et incuber les échantillons dans une chambre humidifiée.
      REMARQUE : Ajustez la durée et la température de chaque incubation avec l’anticorps primaire. Les paramètres typiques sont 2 h à RT ou une nuit à 4 °C.
4. Lavez les échantillons pendant 3 x 5 min avec PBST.
   1. Pour les cellules sur lamelles, transférez-les dans une plaque à 12 puits et ajoutez la solution PBST.
   2. Pour les cultures d’AOH, remplacer la solution d’anticorps par la solution PBST.
5. Vérifiez les sources lumineuses et les filtres disponibles pour le microscope confocal.
6. Choisissez des anticorps secondaires en fonction de l’espèce hôte. Choisissez les paramètres du fluorophore (longueurs d’onde d’excitation et d’émission, largeur du spectre et efficacité d’excitation en fonction de la source lumineuse disponible).
   note: Les paramètres spectraux peuvent être modélisés à l’aide d’outils en ligne (voir Tableau des matériaux).
7. Préparez des solutions d’anticorps secondaires appropriées en les diluant avec une solution bloquante.
8. Incuber avec des anticorps secondaires (comme en 6.3), mais incuber pendant 1 h à 37 °C.
9. Lavez les échantillons comme à l’étape 3.4.
10. Coloration nucléaire et montage sur glissière
    1. Pour les cellules sur lamelles
       1. Aspirez le PBST et remplacez-le par du DAPI (0,2 μg/mL) dans 1 solution PBS.
       2. Incuber les échantillons pendant 10 min à RT dans l’obscurité.
       3. Aspirez la solution DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
       4. Placez les lamelles sur des gouttes de 10 μL de fluide de montage, les cellules vers le bas.
       5. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles.
    2. Pour les cultures AOH
       1. Aspirez le 1x PBST et remplacez-le par du DAPI (0,2 μg/mL) dans 1x solution PBS.
       2. Incuber les échantillons pendant 10 min à RT dans l’obscurité.
       3. Aspirez la solution DAPI et lavez les cellules deux fois avec 1x PBS.
       4. Placez les membranes découpées sur des gouttes de 10 μL de fluide de montage, les cellules vers le haut, et ajoutez un produit de montage supplémentaire (5 μL) à la membrane.
       5. Recouvrez les membranes avec des lamelles.
       6. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles.

4. Microscopie confocale

1. Définissez les pistes en spécifiant les fluorophores utilisés.
2. Choisissez le mode et la vitesse de balayage.
3. Ajustez les valeurs de puissance, de gain et de décalage laser pour chaque fluorophore en les comparant avec les témoins négatifs respectifs : pour les virus, les cellules faussement infectées ; pour les protéines cellulaires, les échantillons colorés avec des anticorps de contrôle d’isotype provenant d’un hôte approprié.
4. Pour acquérir une image 3D, activez le mode z-stack et définissez les limites supérieure et inférieure. Définir la taille du pas/nombre.
   note: Pour plus de détails sur l’imagerie du coronavirus.