Un test de microneutralisation pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants dans le sérum humain

Résumé

Source : Gross, F. L. et al., Mesure des réponses des anticorps neutralisants de la grippe aux virus A(H3N2) dans le sérum humain par des tests de microneutralisation à l’aide de cellules MDCK-SIAT1.J. Vis. Exp.(2017)

Cette vidéo montre des tests de microneutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants à l’aide de cellules rénales canines de Madin-Darby surexprimant l’acide sialique lié à l’α2,6 dans le sérum humain. Ce test est souvent utilisé pour la sérologie humaine de la grippe

Protocole

Tous les virus grippaux doivent être manipulés conformément aux exigences de niveau de biosécurité appropriées (BSL-2 ou supérieur) telles que définies dans la Biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL).

1. Préparation des réactifs et du matériel de départ

1. Préparation de cellules de rein canin Madine Darby-α2,6-sial transférase (MDCK-SIAT1) et milieu de culture cellulaire stérile
   1. Préparez le milieu de culture cellulaire MDCK-SIAT1 à l'aide de 500 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose, 10 % v/v de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 1 mg/mL de sulfate G418 (p. ex., généticine) et 100 U/ml de pénicilline avec 100 μg/mL de streptomycine (facultatif). Stériliser par filtration à travers une membrane de la taille d’un pore de 0,2 μM. Le sulfate G418 est ajouté pour assurer la stabilité plasmidique dans les cellules MDCK-SIAT1.
   2. Préparez la lignée cellulaire MDCK-SIAT1. Dans un ou plusieurs flacons de culture tissulaire^{de 162 cm contenant} 30 mL de milieu de culture cellulaire stérile, des flacons contenant 2 cellules MDCK-SIAT1 de 2,5 x 10⁶ et incuber à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 2 jours ; cela sera utilisé pour la détermination de la dose infectieuse par culture tissulaire (TCID) et les dosages MN.
      note: Les cellules MDCK-SIAT1 ont été aimablement fournies par le Dr M. Matrosovich, Marburg, Allemagne. Cette lignée cellulaire peut également être obtenue dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
2. Préparez le milieu de propagation stérile du virus en utilisant 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose, 0,3 % d'albumine sérique bovine (BSA) fraction V, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 20 mM d'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES). Stériliser par filtration à travers une membrane de la taille d’un pore de 0,2 μM.
3. Préparez 0,75 % (v/v) de globules rouges de cobaye (GPRec) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,01 M de PBS, à un pH de 7,2.
4. Préparez le diluant viral stérile à l’aide de DMEM à haute teneur en glucose, de 1 % d’albumine bovine fraction V (BSA), de pénicilline 100 U/mL, de streptomycine 100 μg/mL et de 20 mM d’HEPES. Stérilisez par filtration à l’aide d’une membrane de la taille d’un pore de 0,2 μm et préparez-vous frais pour chaque dosage.
5. Préparez le fixateur à cellules froides sous forme d’acétone froide à 80 % dans du PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
6. Préparez le tampon de lavage à l’aide de PBS (0,01 M, PBS pH 7,2) et de 0,3 % (v/v) tween-20.
7. Préparez le diluant à base d’anticorps avec du PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), du tween-20 à 0,3 % (v/v) et du lait écrémé en poudre à 5 %.
8. Utilisez des clones d’anticorps monoclonaux de souris A1 et A3 comme anticorps primaires. Diluer dans le diluant de l’anticorps à la concentration optimale déterminée par titrage.
9. Utilisez des IgG anti-souris de chèvre conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP) comme anticorps secondaire. Diluer dans le diluant de l’anticorps à la concentration optimale déterminée par titrage.
10. Préparez le substrat de peroxydase à l’aide de dichlorhydrate d’o-phénylènediamine (OPD) dans un tampon de citrate de phosphate 0,05 M à pH 5. Préparez un tampon de citrate de phosphate de 0,05 M en dissolvant 1 capsule/100 mL de H₂O. Dissoudre 1 comprimé d’OPD (10 mg)/20 mL de tampon de citrate de phosphate immédiatement avant l’utilisation.
11. Utilisez 0,5 M d’acide sulfurique comme solution d’arrêt OPD. Ajouter 28 mL d’acide sulfurique 18 M à 972 mL de H₂O désionisé dans une hotte chimique.
12. Traitement des sérums humains et animaux
    1. Inactiver thermiquement le sérum humain utilisé dans les essais MN dans un bain d’eau à 56 °C pendant 30 minutes avant l’essai. Utiliser immédiatement ou, si nécessaire, conserver le sérum décongelé à 4 °C pendant 24 h au maximum ; si une période de conservation plus longue est nécessaire, conservez le sérum, congelé à -20 °C ou moins.
    2. Traiter le sérum animal utilisé dans les essais MN avec l’enzyme destructrice de récepteur (RDE) et inactivé par la chaleur avant l’essai comme suit.
       1. Décongelez le sérum dans un bain-marie à 37 °C puis placez-le sur de la glace. Mélangez 1 volume d’échantillon de sérum animal avec 3 volumes de RDE. Incuber à 37 °C pendant 18 à 20 h.
       2. Inactiver à la chaleur le sérum traité par RDE à 56 °C pendant 30 min. Ajouter 6 volumes de PBS, pH 7,2 à chaque échantillon pour une pré-dilution finale de 1:10. Si nécessaire, conserver le sérum décongelé à 4 °C pendant 24 h au maximum ; si une période de conservation plus longue est nécessaire, conservez le sérum congelé à -20 °C ou moins.
          note: Les sérums animaux peuvent contenir divers glycanes d’acide sialique qui peuvent se lier aux hémagglutinines ou AH des virus de la grippe et inhiber la liaison des anticorps anti-HA spécifiques de la grippe. Par conséquent, il est nécessaire de traiter tous les sérums animaux avant les tests MN afin d’éliminer ces liants non spécifiques de l’HA viral dans les échantillons de sérum.

2. Passage de la culture cellulaire MDCK-SIAT1

REMARQUE : Toutes les cultures cellulaires doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter toute contamination.

1. Décanter le milieu de culture cellulaire de la monocouche cellulaire dans 2 flacons de¹⁶² cm. Trypsinisez les cellules en rinçant la monocouche avec de l’acide trypsine-éthylènediamine tétraacétique (EDTA). Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA pour couvrir la monocouche cellulaire. Incuber à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone, CO₂ jusqu’à ce que la monocouche se détache (5-10 min). Ajouter 15 mL de milieu de culture cellulaire MDCK-SIAT1 dans chaque flacon contenant des cellules trypsinisées, et pipeter de haut en bas pour séparer les cellules.
2. Utilisez un hémocytomètre et du bleu trypan pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité. Ensemencer les cellules dans de nouveaux flacons de culture tissulaire de^{162 cm contenant} 30 mL de milieu de culture cellulaire avec 2-2,5 x 10⁶ cellules/fiole et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 2 jours pour utilisation dans les essais de TCID et de MN. Semez les cellules à 4 - 5 x 10⁶ cellules/ballon et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 2 jours pour une utilisation dans la propagation du virus.
   note: La densité de semis peut être ajustée si des périodes de culture plus courtes ou plus longues sont souhaitées. Pour la propagation du virus, les cellules doivent atteindre une confluence supérieure à 100 %. Pour les tests TCID (Tissue Culture Infection Dose) et MN, les cellules doivent avoir une confluence de 75 à 95 % (Figure 1).

3. Propagation des virus A(H3N2) dans les cellules MDCK-SIAT1

REMARQUE : Le virus A(H3N2) peut être multiplié soit dans des œufs de poule embryonnés âgés de 10 à 11 jours selon le protocole standard, soit dans des cultures cellulaires MDCK-SIAT1. Les cellules MDCK-SIAT1 doivent atteindre une confluence supérieure à 100 % pour l’inoculation du virus. Les stocks de semences virales peuvent être inoculés avec plusieurs dilutions d’inoculum. Les dilutions de l’inoculum avec la meilleure HA de récolte et la meilleure infectiosité peuvent être utilisées pour d’autres tests de MN.

1. Retirer le milieu de culture cellulaire de la monocouche cellulaire (>100 % de confluence) dans² flacons de 162 cm. Lavez la monocouche deux fois avec 15 ml de PBS stérile à 0,01 M, pH 7,2 et décantation.
2. Étiqueter 1 fiole comme témoin et ajouter 20 mL de milieu de propagation du virus. Incuber le ballon à 37 °C avec 5 % de CO₂. Laissez cette fiole intacte et utilisez-la à des fins de comparaison après le 1er jour de propagation du virus.
3. Ajouter 10 mL de milieu de propagation du virus stérile dans le ou les ballons et incuber tous les ballons à 37 °C, 5 % de CO₂. Décongelez une fiole de bouillon du virus de la grippe à température ambiante, puis placez-la sur de la glace. Diluer avec le milieu de propagation du virus jusqu’aux dilutions cibles.
   note: Les dilutions cibles peuvent être ajustées en fonction des titres d’HA des stocks de virus. Pour préparer un inoculum dilué à l’échelle 1:1000, ajoutez 100 μL de virus à 9,9 ml de milieu de propagation stérile du virus. Retournez doucement, retirez 1 mL de dilution 1:100 pour 9 mL de milieu de propagation stérile du virus et retournez doucement pour obtenir un inoculum dilué 1:1000. Placer sur de la glace.
4. Retirer de l’incubateur toutes les fioles, à l’exception de la fiole de contrôle. Retirer le milieu de propagation du virus de la ou des fioles des cellules MDCK-SIAT1 et inoculer chaque fiole avec 10 mL de virus dilué. Incuber les flacons à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 1 h, en tournant le(s) flacon(s) toutes les 15 min.
5. Retirer 5 mL d’inoculum de la ou des fioles et les remplacer par un milieu de propagation du virus de 15 mL contenant 1 μg/mL de trypsine traitée au Tosyl phénylalanyl chlorométhyl cétone (TPCK-trypsine). Incuber le(s) flacon(s) à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 16-18 h.
6. Après l’incubation d’une nuit, observez le(s) flacon(s) sous un grossissement microscope de 100X et recherchez des effets cytopathiques (EPC) sur les cellules. Retirer 15 à 17 mL de surnageant viral de la ou des fioles et les remplacer par 15 à 17 mL de milieu de propagation du virus fraîchement préparé contenant 2 μg/mL de TPCK-trypsine.
7. Incuber les flacons à 37 °C, 5 % CO₂. Surveiller le CPE de la monocouche (par comparaison avec le ballon de contrôle cellulaire) et vérifier l’AH périodiquement (toutes les 4 h) avec 0,75 % de gpGR jusqu’à la récolte.
   1. Mettre en place une plaque de microtitration HA 96 puits. Ajouter 50 μL de PBS 0,01 M, pH 7,2 aux puits A2 - A12 et B2 - B12 (doublons) et aux puits H1 à H12 pour le contrôle.
   2. Ajouter 100 μL de surnageant viral à A1 et A2, et effectuer une dilution en série 2 fois de A1 et B1 à A12 et B12. Jeter 50 μL après avoir mélangé A12 et B12. Ajouter 50 μL de globules rouges à 0,75 % dans les rangées A, B et H.
   3. Tapotez la plaque et laissez incuber à température ambiante pendant 1 h.
      1. Déterminer l’HA du surnageant viral en inclinant la plaque de microtitration à 96 puits à un angle de 45° à 60°.
      2. Lire les plaques pour l’hémagglutination ; la dilution la plus élevée du virus qui permet d’obtenir une hémagglutination complète est considérée comme le critère d’évaluation de la titration de l’HA pour le virus spécifique. Enregistrer l’inverse de la dilution virale la plus élevée avec hémagglutination complète comme titre HA du virus.
         note: Les globules rouges stabilisés de la rangée H (témoins) doivent commencer à « courir » et former une petite forme de goutte d’eau en raison de la gravité. Attendez que les globules rouges dans les puits de contrôle aient fini de fonctionner, puis lisez les boutons des globules rouges dans les puits de titrage du virus. Ceux qui présentent des boutons de globules rouges et « run », n’atteignent pas l’hémagglutination. Localiser la dilution la plus élevée du virus qui inhibe complètement l’hémagglutination comme titre final HA du virus.
8. Récoltez le virus lorsque l’HA de la culture virale atteint un plateau ou que la culture virale atteint l’HA cible (par exemple, >unité HA 16), mais avant que la monocouche cellulaire ne commence à présenter des CPE significatifs.
   1. Centrifuger le surnageant de culture virale à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les débris cellulaires. Transférez le surnageant clarifié contenant la récolte du virus dans un tube propre. Aliquote du surnageant contenant le virus, récoltez-le dans des flacons cryogéniques stériles à usage unique et congelez-le immédiatement à -70 °C ou moins.
      note: Les stocks de virus utilisés pour les tests MN doivent avoir un titre infectieux élevé et un minimum de particules défectueuses. La dilution minimale des stocks de virus pour atteindre 100 TCID₅₀/50 μL pour le dosage MN est de 1:100.
      note: Les stocks de virus utilisés dans les tests MN ne doivent pas être décongelés et recongelés.

4. Détermination de la TCID du virus

1. Jour 1 : Titrage du virus
   1. Décongelez un flacon du virus à température ambiante et placez-le immédiatement sur de la glace.
   2. Testez le virus à deux dilutions de départ différentes : ^10-2 et ^10-3. Ajouter 100 μL de virus à 9,9 mL de diluant viral pour une dilution ^10-2. Ajouter 1 mL de dilution ^10-2 à 9,0 mL de diluant viral pour dilution ^10-3.
   3. À l’aide de deux plaques de microtitration (plaque 1 pour une dilution ^10-2 et plaque 2 pour une dilution ^10-3), ajouter 100 μL de diluant viral dans tous les puits, sauf la colonne 1 de la plaque de microtitration à 96 puits.
   4. Effectuer des dilutions 1/2log₁₀ (^10-2, ^10-2,5, ^10-3, etc.). Ajouter 146 μL du virus en début de dilution dans tous les puits de la colonne 1 et transférer 46 μL en série de la colonne 1 à la colonne 11 (figure 2). Changez les pointes de pipette entre les puits. Après avoir mélangé la colonne 11, jeter les pointes avec la dilution de 46 μL.
   5. Utilisez la colonne 12 comme contrôle cellulaire (CC) ; elle ne contient que du diluant viral. Incuber pendant 1 h à 37 °C, 5 % CO_2.
2. Jour 1 : Préparation des cellules MDCK-SIAT1
   note: La monocouche cellulaire MDCK-SIAT1 doit atteindre une confluence de 75 à 95 % pour les dosages TCID et MN. Une fiole de² cm de 162 cm à 95 % de confluence devrait produire suffisamment de cellules pour ensemencer ~ 4 à 5 plaques de microtitration.
   1. Laver la monocouche confluente de 75 à 95 % avec 20 ml de PBS pour éliminer le FBS dans le milieu de culture. Essayez les cellules comme suit.
      1. Rincez la monocouche avec du PBS stérile et ajoutez 7 ml de trypsine-EDTA pour couvrir la monocouche cellulaire. Poser le ballon à plat et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ jusqu’à ce que la monocouche se détache (environ 5 à 10 min). Ajouter 7 mL de diluant viral dans chaque fiole contenant les cellules trypsinisées.
   2. Lavez les cellules avec un diluant viral pour éliminer le FBS.
      1. Pipetez doucement de haut en bas pour séparer les cellules. Transférez les cellules dans un tube conique de 50 ml ; Remplissez le tube avec un diluant antivirus.
      2. Centrifuger à 485 x g pendant 5 min. Décanter le diluant viral, le remplacer par 50 mL de diluant viral frais et centrifuger à 485 x g pendant 5 min. Décanter le diluant viral et le remplacer par un diluant viral frais (10 mL/flacon) pour remettre la pastille en suspension.
   3. Utilisez un hémocytomètre et du bleu trypan pour déterminer le nombre et la viabilité des cellules. Ajuster la concentration cellulaire avec le diluant viral à 1,5 x 10⁵ cellules/mL.
   4. Ajouter 100 μL de cellules MDCK-SIAT1 diluées dans chaque puits des plaques de microtitration (1,5 x 10⁴ cellules/puits) et couvrir les plaques. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 18 à 20 h.
3. Jour 2 : ELISA
   1. Fixation des cellules
      1. Retirez le milieu des plaques de microtitration. Lavez chaque puits avec 200 μL de PBS. Ajouter 300 μL d’acétone froide à 80 % dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 min. Retirez le fixateur et laissez les plaques sécher à l’air.
   2. Test ELISA
      1. Ajout d’anticorps primaires
         note: L’anticorps monoclonal antigrippal A NP doit être utilisé en excès comme anticorps primaire dans l’ELISA. Déterminez la dilution optimale des anticorps pour chaque lot d’anticorps primaires en effectuant des titrages d’anticorps en MN. Sélectionnez la concentration d’anticorps primaires qui est en excès et avec le meilleur rapport signal/bruit de fond.
         1. Diluer l’anticorps monoclonal NP antigrippal A (anticorps primaire) à la concentration cible dans le diluant de l’anticorps (p. ex. ajouter 30 μL d’anticorps primaires à 30 mL de diluant d’anticorps pour une dilution cible de 1:1000).
         2. Laver les plaques 3 fois avec 300 μL de tampon de lavage. Ajouter 100 μL d’anticorps primaires dilués dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
      2. Ajout d’anticorps secondaires
         REMARQUE : L’immunoglobuline anti-souris de chèvre, IgG conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) doit être utilisée en excès comme anticorps secondaire dans l’ELISA. Déterminez la dilution optimale des anticorps pour chaque lot d’anticorps secondaires en effectuant des titrages d’anticorps. Sélectionnez la concentration d’anticorps secondaires en excès et avec le meilleur rapport signal/bruit de fond.
         1. Diluer les IgG anti-souris de chèvre conjuguées à l’anticorps HRP (anticorps secondaire) jusqu’à la concentration cible dans le diluant d’anticorps (p. ex. ajouter 7,5 μL d’anticorps secondaires à 30 mL de diluant d’anticorps pour une dilution cible de 1:4000).
         2. Lavez les plaques 3 fois avec un tampon de lavage de 300 μL. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires dilués dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
      3. Ajout de substrat et lecture de plaque
         1. Lavez les plaques 5 fois avec un tampon de lavage de 300 μL et tapotez sur une lingette non pelucheuse.
         2. Ajouter 100 μL de substrat fraîchement préparé dans chaque puits et incuber à température ambiante jusqu’à ce que le développement de la couleur sature et que la densité optique (DO) des puits de contrôle cellulaire <0,2.
         3. Ajouter 100 μL de solution d’arrêt dans tous les puits. Lire le diamètre extérieur des puits à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de microplaques.
4. Calcul de la TCID ₅₀
   1. Calculer la DO médiane_{de 490} des témoins de cellule (colonne 12).
   2. Considérez comme « positif » tout puits d’essai avec une DO₄₉₀ supérieure à deux fois la DO médiane₄₉₀ des puits CC ; sinon, il est considéré comme « négatif ».
   3. Calculer la DTC₅₀ du virus à l’aide de la méthode de Reed-Muench.
      1. Déterminez le nombre de points positifs et négatifs à chaque dilution.
      2. Calculez les « positifs cumulatifs », les « négatifs cumulatifs », les « ratios » et les « % positifs » comme illustré dans le tableau 1.
      3. Calculez la « distance proportionnelle » entre la dilution montrant >50 % de positifs et la dilution montrant <50 % de positifs en utilisant ce qui suit :
         5. Dosage MN à l’aide de cellules MDCK-SIAT1
         1. Jour 1 : Test et préparation des sérums de contrôle et disposition des plaques
            1. Décongelez le sérum dans un bain-marie à 37 °C et retirez-le immédiatement après la décongélation. Déterminer la quantité de sérum à analyser ; un minimum de 10 μL de sérum original est nécessaire pour effectuer le test avec un virus dans un singulet. Testez les sérums en double si possible.
            2. La chaleur inactive le sérum humain pendant 30 minutes dans un bain-marie à 56 °C comme à l’étape 1.12.1. Placez le sérum sur de la glace après l’inactivation de la chaleur et ajoutez le diluant viral au sérum pour obtenir une prédilution de 1:10.
            3. Traiter et prédiluer les sérums animaux à 1:10 pour les témoins selon 1.12.2.
               note: Les sérums humains et animaux décongelés et traités peuvent être conservés à 4 °C pendant une période maximale de 24 h. Les sérums doivent être conservés congelés à -20 °C ou moins si une période de conservation plus longue est nécessaire avant le dosage.
            4. Pour tester avec un virus, ajoutez 100 μL de sérum dilué 1:10 dans les colonnes A1 à A10 (figure 3). Ajouter 50 μL de diluant viral aux rangées B à H, à l’exception des colonnes 11 et 12 (figure 3). Effectuez une dilution en série de 2 fois à partir des rangées A à H et jetez les 50 derniers μL de la rangée H (Figure 3).
               note: Lorsque plusieurs virus doivent être testés, les sérums peuvent être dilués dans des tubes de titrage. La dilution du sérum, pour déterminer le titre sérique, dans le puits A est de 1:10, le puits B de 1:20, le puits C de 1:40, le puits D de 1:80, le puits E de 1:160, le puits F de 1:320, le puits G de 1:640, le puits H de 1:1 280 (figure 3).
            5. Pour le contrôle du virus, ajoutez 50 μL de diluant viral dans les puits A12, B12, C12 et D12 (sans sérum). Pour le contrôle cellulaire, ajoutez 100 μL de diluant viral dans les puits E12, F12, G12 et H12 (pas de virus, pas de sérum).
            6. Pour les sérums témoins (par exemple, les sérums de furet), ajouter 100 μL de sérums témoins dilués dans la colonne 11 du puits A et ajouter 50 μL de diluant viral dans les puits B11 à H11. Diluer en série.
            7. Couvrir les plaques et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’ajout du virus.
         2. Jour 1 : Ajout du virus
            1. Diluer le virus à 100 DICTC₅₀/50 μL avec un diluant viral.
            2. Ajouter 50 μL de virus dilué dans tous les puits, à l’exception de la colonne 11 sur les plaques de titrage arrière (BT) et des puits de contrôle des cellules E12, F12, G12 et H12 sur toutes les plaques (figure 3). Pour les plaques contenant des sérums témoins dans la colonne 11, ajoutez le virus à la colonne 11.
            3. Titrage arrière (BT)
               1. Incluez un BT dans la colonne 11 d’un ensemble de plaques en double (par exemple, les plaques 1A et 1B). Ajouter 50 μL de diluant viral dans tous les puits de la colonne 11. Ajouter 50 μL du virus à 100 DICTC₅₀/50 μL dans le premier puits (A11). Mélanger par pipetage de haut en bas.
               2. Mélanger et transférer 50 μL dans des puits successifs pour effectuer des dilutions en série de 2 fois. Changez les pointes de pipette entre les puits pour éviter la propagation du virus. Jeter 50 μL du puits H11.
               3. Ajouter 50 μL de diluant viral dans la colonne 11 pour porter le volume final à 100 μL. Tapoter les plaques pour mélanger.
            4. Incuber les plaques à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 1 h.
            5. Effectuez l’ajout de cellules MDCK-SIAT1 le jour 1 et l’ELISA le jour 2 comme décrit aux étapes 4.2 et 4.3 (également décrit aux sections 5.3 et 5.4)
         3. Jour 1 : Ajout de cellules MDCK-SIAT1
            1. Préparez les cellules MDCK-SIAT1 comme décrit à l’étape 4.2. Ajouter 100 μL de cellules MDCK-SIAT1 à raison de 1,5 x 10⁵ cellules/mL dans chaque puits (1,5 x 10⁴ cellules/puits). Incuber les plaques à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 18 à 20 h.
         4. Jour 2 : ELISA
            1. Après une nuit d’incubation, le deuxième jour, fixez les cellules avec de l’acétone froide à 80 % comme décrit à l’étape 4.3.
            2. Ajout d’anticorps primaires
               1. Lavez les plaques 3 fois avec un tampon de lavage de 300 μL. Diluer l’anticorps monoclonal NP antigrippal A (anticorps primaire) à la concentration optimale déterminée par titrage dans le diluant d’anticorps (p. ex. ajouter 30 μL d’anticorps primaire à 30 mL de diluant d’anticorps pour une dilution cible de 1:1000).
                  REMARQUE : 100 μL d’anticorps primaires sont nécessaires par puits. ~10 mL sont nécessaires par assiette.
               2. Ajouter 100 μL d’anticorps primaires dilués dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
            3. Ajout d’anticorps secondaires
               1. Laver les plaques 3 fois avec un tampon de lavage de 300 μL. Diluer les IgG anti-souris de chèvre conjuguées à l’anticorps HRP (anticorps secondaire) à la concentration cible dans le diluant d’anticorps (p. ex. ajouter 7,5 μL d’anticorps secondaires à 30 mL de diluant d’anticorps pour une cible de 1:4000).
                  REMARQUE : 100 μL d’anticorps secondaires sont nécessaires par puits 96. ~10 mL sont nécessaires par assiette.
               2. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires dilués dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
            4. Ajout de substrat et lecture de plaque
               1. Lavez les plaques 5 fois avec un tampon de lavage de 300 μL et tapotez sur la lingette non pelucheuse.
               2. Ajouter 100 μL de substrat fraîchement préparé dans chaque puits et incuber à température ambiante jusqu’à ce que les puits de contrôle du virus atteignent une DO₄₉₀ = 0,8 - 3, avec le contrôle cellulaire à un faible niveau de fond_{de DO 490} <0,2.
               3. Ajouter 100 μL de la solution d’arrêt dans tous les puits. Lire le diamètre extérieur des puits à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de microplaques.
         5. Analyse des données
            note: Les calculs de MN sont déterminés pour chaque plaque individuellement.
            1. Déterminez le titre d’anticorps neutralisants de chaque échantillon de sérum.
               1. Calculez le seuil OD₄₉₀ de 50 % de neutralisation virale pour chaque plaque à l’aide de l’équation suivante :
                  

Résultats

Graphique 1. Culture cellulaire MDCK-SIAT1.Cellules MDCK-SIAT1. (A) monocouche confluente MDCK-SIAT1 (>100 % de confluence) pour l’inoculation du virus ; (B) Cellules MDCK-SIAT1 en phase logarithmique avec une confluence de 75 à 95 % pour les dosages TCID₅₀ et MN.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec une teneur élevée en glucose	Sciences de la vie	11965	Un composant essentiel de la culture cellulaire stérile, de la propagation du virus et des milieux de diluant
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SH30070.03
Albumine sérique bovine (BSA) fraction V, sans protase	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamine	Sciences de la vie	Référence 25030-081
Pyruvate de sodium	Sciences de la vie	Référence 11360-070
Sel de disulfate de Geneticin G-418	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Sciences de la vie	Référence 15630-080
Pénicilline/streptomycine	Sciences de la vie	Référence 15140-122
acétone	VWR	Référence 67-64-1	Utilisé à une concentration de 80 %
Tampon phosphate-citrate avec perborate de sodium	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
Comprimé de dichlorhydrate d’O-phénylènediamine	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 comprimé pour 100 ml d’eau de culture cellulaire
acide sulfurique	Fisher Scientific	A510-P500	Concentration finale utilisée de 0,5 M
Éthanol, dénaturé, 4L	VWR	Référence EM-AX0422-3	Utilisé à une concentration de 70 %
Trypsine-EDTA	Sciences de la vie	1748048
RDE II « Seiken »	Denka Seiken	370013
Préadolescent 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Ab monoclonal de souris anti-NP	Piscine Millipore	MAB 8257 MAB 8258
IgG HRP anti-souris	KPL	Référence 074-1802
Plaques à fond plat à 96 puits	Thermo Scientific	Référence 3455
Lecteur de plaques	Dispositif moléculaire	Spectromax 384 plus
Flacon de culture cellulaire 162 cm2/Bouchon d’aération	Corning/VWR	Référence 3151

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