Un test pour détecter l’explosion oxydative dans les disques de feuilles d’Arabidopsis lors de l’élicitation immunitaire

Résumé

Source : Bredow, M., et al. Essais d’explosion oxydative déclenchée par motif et d’inhibition de la croissance des plantules chez Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre un test permettant de mesurer l’explosion oxydative dans les feuilles d’Arabidopsis lors de l’élicitation immunitaire. Les disques de feuilles, coupés dans les feuilles des plantes, sont incubés avec des peptides bactériens fonctionnant comme des motifs moléculaires associés aux microbes ou MAMP. Lors de la détection des MAMPs, les cellules végétales induisent la production de ROS extracellulaires, qui sont détectés à l’aide d’un test de chimiluminescence.

Protocole

1. Détection de l’éclatement des ROS dans les disques foliaires d’Arabidopsis suite à une élicitation immunitaire

1. Croissance et entretien des plantes.
   1. Pour synchroniser la germination, stratifiez les graines d’Arabidopsis en suspendant environ 50 graines dans 1 mL de gélose stérile à 0,1 % [p/v] et conservez-les à 4 °C (sans lumière) pendant 3 à 4 jours.
      note: Stratifier un contrôle de fond de type sauvage (par exemple, Col-0) et des génotypes avec des sorties immunitaires élevées et faibles (par exemple, cpk28-1 et bak1-5, respectivement) pour servir de contrôles internes.
   2. Semez les graines sur le sol et faites germer dans des conditions standard de jours courts (22 °C, 10 h de lumière, 150 μE/m²/s d’intensité lumineuse et 65-70 % d’humidité relative).
   3. Après environ 7 jours, utilisez des pinces pour transplanter les semis individuels dans de nouveaux pots, séparés d’au moins 4 cm pour permettre le développement complet de la rosette. Repiquez 6 à 12 semis par génotype et revenez aux conditions standard de jours courts. Arrosez et fertilisez régulièrement les plantes (1 g/L d’engrais 20-20-20 toutes les 2 semaines).
2. Prélever les disques foliaires dans des plaques de 96 puits pour une récupération pendant la nuit.
   1. 4 à 5 semaines après la germination (figure 1A), à l’aide d’un poinçon de biopsie de 4 mm, prélever un disque foliaire par plante, en évitant la nervure médiane et en prenant soin de limiter les blessures (figure 1B). Placez les disques foliaires dans une plaque de luminomètre à 96 puits inutilisée contenant 100 μL d’eau distillée double (ddH₂O) avec le côté adaxial vers le haut pour éviter la dessiccation (figure 1C). Si vous évaluez plusieurs éliciteurs, retirez 1 disque foliaire de la même feuille pour chaque traitement d’éliciteur.
      note: Échantillonnez les feuilles qui sont complètement développées, de la troisième à la cinquième à partir du haut de la rosette, et qui ont à peu près la même taille et le même âge pour limiter la variabilité. Si possible, coupez les disques de feuilles en deux à l’aide d’une lame de rasoir avant de les récupérer pendant la nuit, car cela augmente la surface exposée à la solution d’éliciteur.
   2. Récupérer pendant la nuit à température ambiante pour éviter l’interférence des ROS produits par les blessures lors de la collecte des disques foliaires. Couvrez les plaques avec un couvercle pour éviter l’évaporation.
3. Effectuez le traitement par éliciteur et mesurez la production de ROS.
   1. Programmez le lecteur de plaques avant d’ajouter la solution réactionnelle, car cela réduira le temps entre le lancement de l’explosion de ROS et les premières mesures enregistrées. Utilisez un logiciel commercial adapté au lecteur de plaques. Dans notre cas (voir la table des matières), cliquez sur Paramètres et sélectionnez la cartouche LUM96 et le type de lecture cinétique. Cliquez sur la catégorie Zone de lecture et faites-la glisser pour sélectionner un sous-ensemble de puits ou la plaque entière à lire. Sous l’onglet PMT et optique, définissez le temps d’intégration sur 1 000 ms. Sous l’onglet Chronométrage, réglez la durée totale de l’exécution sur 40-60 min et l’intervalle sur 2 min.
   2. Prélever l’eau de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
      note: Ne percez pas les disques à feuilles, car cela pourrait causer des blessures et entraîner des sorties ROS plus variables.
   3. Préparez une solution réactionnelle contenant 100 μM de luminol, 10 μg/mL de peroxydase de raifort (HRP) et la concentration souhaitée d’éliciteur (par exemple : elf18 à 1 nM, 10 nM, 100 nM ou 1 000 nM) dans du ddH₂O stérile en utilisant 10 mL de solution pour une plaque à 96 puits.
      note: Dissoudre les peptides lyophilisés dans du H₂O stérile dans des tubes à faible liaison pour obtenir un stock de 10 mM, les congeler rapidement dans le liquide N₂ et les conserver à -80 °C. Lorsqu’ils sont prêts à l’emploi, diluer les stocks dans du H₂O stérile pour générer un stock de travail de 100 μM et les stocker à -20 °C.
   4. À l’aide d’une pipette multicanaux, versez 100 μL du mélange réactionnel dans chaque puits, en ajoutant la solution à tous les disques à feuilles du même traitement en même temps. Inclure une réaction de contrôle (pas d’éliciteur) pour chaque génotype afin d’évaluer les taux de ROS basaux en l’absence d’élicitation. Mesurez immédiatement l’émission lumineuse pour toutes les longueurs d’onde du spectre visible à l’aide d’un lecteur de microplaques.
      note: Préparez et appliquez la solution réactionnelle sous une faible lumière, car le luminol et le HRP sont des réactifs sensibles à la lumière. Conservez les réactifs sur de la glace ou à -20 °C sauf en cas d’utilisation.
   5. Mesurer l’émission lumineuse avec un temps d’intégration de 1 000 ms à des intervalles de 2 minutes sur une période de 40 à 60 minutes dans un lecteur de microplaques afin de capturer le sursaut oxydatif dynamique (Figure 1D).
      note: Utilisez un temps d’intégration plus long pour améliorer la sensibilité du dosage, tout en veillant à ce que tous les échantillons d’une plaque de 96 puits puissent être mesurés dans un intervalle.

Résultats

Graphique 1. Essai d’éclatement oxydatif à base de luminol après induction immunitaire chez Arabidopsis. (A) Cultivez les plantes sur le sol dans des conditions de jours courts pendant 4 à 5 semaines. (B) Utilisez un poinçon de biopsie de 4 mm pour prélever les disques foliaires de chaque plante et récupérer pendant la nuit en ddH2O. (C) Ajouter une solution réactionnelle (100 μM de l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
20-20-20 Engrais	Plant Prod	Référence 10529	Mélangez 1 g/L dans de l’eau et appliquez sur les plantes toutes les 2 semaines pour une croissance optimale.
Poinçon de biopsie de 4 mm	Pharmacie Médicale	Référence 232-33-34-P	Un kit de perceuse de liège d’une surface de 0,125 cm^2 peut également être utilisé.
Pipette mécanique multicanaux BioHit mLine 12 (30-300 uL)	Sartorius	Référence 725240	N’importe quelle pipette multicanaux peut être utilisée, ainsi qu’un seul pipeteur si nécessaire.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	Réf. CP7211	Stocker 10 mM de peptide stock à -80 °C dans des tubes à faible teneur en protéines. Une fois décongelé, stockez le stock de travail de 100 uM à -20 °C.
forceps	Fisher Scientific	Référence 22-327379
Peroxydase de raifort	Sigma-Aldrich	Réf. P6782	Dissoudre dans de l’eau pure. Conserver à -20C et à l’abri de la lumière.
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	Dissoudre dans le DMSO. Conserver à -20C et à l’abri de la lumière.
Sels de base de Murisage et Skoog	Laboratoires Cedarlane	MSP09-100LT	Magasin au 4C.
terre	SunGrow Horticulture	Mélange Sunshine #1	D’autres types de sol peuvent également être utilisés pour cultiver Arabidopsis. Mélanger avec de l’eau lors du remplissage des casseroles.
SpectraMax Paradigm Lecteur de microplaques multimode avec module LUM	Dispositifs moléculaires		Tout lecteur de plaques capable de détecter la luminescence peut être utilisé pour ces dosages.
Plaques en polystyrène blanc à 96 puits	Fisher Scientific	Tél. : 07-200-589