Mesure de l’inhibition de la croissance des plantules induite par le système immunitaire

Résumé

Source : Bredow, M. et al., Essais d’explosion oxydative déclenchée par motif et d’inhibition de la croissance des plantules chez Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Cette vidéo montre le test d’inhibition de la croissance des plantules chez la plante Arabidopsis thaliana. L’impact d’une concentration accrue d’éliciteur de peptides immunitaires sur la croissance des plantules est déterminé.

Protocole

1. Essai d’inhibition de la croissance des plantules

1. Stérilisez les graines et semez sur des plaques Murashige et Skoog (MS).
   1. Préparez un milieu MS demi-fort stérile (0,5x) (2,16 g/L) contenant 0,8 % de gélose [p/v]. Verser le support dans des plaques (90 x 15 mm) dans une hotte à flux laminaire.
   2. Stérilisez environ 100 graines dans un tube de microcentrifugation en les lavant avec 1 mL d’éthanol à 70 % pendant 2 minutes et retirez-les par aspiration. Ajouter 1 ml d’eau de Javel à 40 % et secouer doucement pendant 17 minutes à température ambiante. Enlever l’eau de Javel par aspiration et laver trois fois dans 1 mL d’eau stérile pendant 5 min. Remettre en suspension dans 1 mL d’agar.
      note: Vous pouvez également utiliser un protocole de stérilisation des graines de chlore gazeux24.
   3. Semez environ 100 graines par génotype sur des plaques de gélose MS à l’aide d’une pipette et scellez avec du ruban microporeux dans une hotte à flux laminaire.
      note: Évitez de placer les graines à proximité car cela rendra le repiquage des semis difficile plus tard.
   4. Stratifiez les graines en plaçant des plaques à 4 °C (sans lumière) pendant 3-4 jours pour synchroniser la germination (Figure 1A).
2. Transplantez les semis dans des plaques de 48 puits contenant des peptides d’élicitation immunitaire.
   1. Après la stratification, mettre les plaques à la lumière dans des conditions de jours courts (22 °C, 10 h de lumière, intensité lumineuse de 150 μE/m²/s et 65-70 % d’humidité relative) pendant 3-4 jours pour permettre la germination.
   2. Dans une hotte à flux laminaire, préparer des dilutions de peptides éliciteurs (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM et 1 000 nM) dans un milieu liquide stérile 0,5x MS contenant 1 % de saccharose [p/v], en utilisant 25 mL de MS pour chaque plaque de 48 puits. Préparez les plaques en pipetant 500 μL de milieu liquide MS ou de milieu MS contenant des peptides par puits. Si possible, utilisez un pipeteur répété pour la préparation de la plaque afin d’accélérer le processus.
      note: Pour chaque génotype, cultivez des semis dans la SEP sans éliciteur pour tenir compte de toute différence inhérente à la croissance des plantules.
   3. À l’aide d’une pince stérile, transplantez soigneusement un semis dans chaque puits de la même taille et du même âge, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de dommages au semis ou de casse de la racine et que la racine soit immergée dans le milieu. Pour chaque génotype, transplantez un minimum de 6 à 8 plantules dans chaque dilution de peptide (Figure 1B).
      note: Repiquez les semis 4 jours après la germination, car les racines courtes sont plus faciles à manipuler et les semis plus âgés peuvent donner des résultats moins optimaux.
   4. Scellez les plaques avec du ruban adhésif microporeux et revenez à la lumière dans des conditions standard de jours courts (22 °C, 10 h de lumière, intensité lumineuse de 150 μE/m²/s et 65-70 % d’humidité relative). Laissez les semis pousser pendant 8 à 12 jours.

2. Déterminez le pourcentage d’inhibition de la croissance.

1. Retirez soigneusement les semis des assiettes de 48 puits et séchez-les en les tamponnant sur une serviette en papier. Pesez les semis sur une balance analytique et notez les valeurs. Si possible, utilisez une balance analytique équipée d’une sortie USB pour enregistrer les valeurs de poids frais sur une feuille de calcul. Avant de peser les semis, prenez une photo pour montrer visuellement l’inhibition de la croissance (figure 1C).
2. Déterminer le pourcentage d’inhibition de la croissance des plantules traitées par élicitor par rapport aux plantules cultivées dans la région MS uniquement comme suit :
   

Résultats

Graphique 1. Essai d’inhibition de la croissance des plantules induit par l’élicitor chez Arabidopsis. (A) Semez les semis sur de la gélose MS et cultivez pendant 3 à 4 jours dans des conditions standard de jours courts. (B) Repiquer les semis dans des plaques à 48 puits contenant un milieu MS ou un MS contenant différentes concentrations d’elf18. (C) Après 8 à 12 jours, évaluer visue...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques stériles à 8 puits avec couvercle	Sigma-Aldrich	CLS3548
Balance analytique avec barbette de tirage	VWR	VWR-225AC	N’importe quelle balance analytique standard peut être utilisée pour les essais d’initiation de croissance, cependant, une sortie informatique directe est optimale.
Pipette mécanique multicanaux BioHit mLine 12 (30-300 uL	Sartorius	Référence 725240	N’importe quelle pipette multicanaux peut être utilisée, ainsi qu’un seul pipeteur si nécessaire.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	Réf. CP7211	Stocker 10 mM de peptide stock à -80 °C dans des tubes à faible liaison protéique. Une fois décongelé, stockez le stock de travail de 100 uM à -20 °C.
Sels de base de Murisage et Skoog	Laboratoires Cedarlane	MSP09-100LT	Conserver à 4 °C.
Plaques en polystyrène blanc à 96 puits	Fisher Scientific	Tél. : 07-200-589