REMARQUE : Le protocole s’applique à différents tissus végétaux. La gaine de riz et les disques foliaires ont été utilisés dans ce protocole pour la détection des ROS lors de l’élicitation du PAMP. Étant donné que les différences sont principalement dues à la méthode d’échantillonnage, seules les procédures courantes sont décrites ci-dessous, avec des étapes spécifiques mentionnées si nécessaire.
1. Préparation et prétraitement des tissus
- Gaine de riz
- Coupez la gaine des plants de riz de 10 jours en segments de 3 mm à l’aide d’une lame de rasoir tranchante ou d’une lame chirurgicale pour le prétraitement 1 jour avant le test ROS (Figure 1B).
- Placez cinq segments de gaine dans un puits individuel d’une plaque de microtitration de 96 puits contenant 100 μL d’eau doublement distillée (ddH2O) pendant 10 à 12 h, dans l’obscurité à 25 °C, ce qui permet de réduire les fuites d’ions liées aux lésions de la plaie et les réponses de défense (Figure 2).
note: Prendre soin de garder les coupes verticales pour assurer une surface de coupe constante exposée à la solution d’élicitation est une étape importante pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Déplacez doucement les segments. Ne faites pas de coupures ou de blessures supplémentaires sur les segments, qui pourraient être une source de variation des données. En principe, chaque test doit contenir au moins cinq répétitions car la variation de la valeur ROS est importante. Plus il y a de répétitions, plus les données sont fiables.
- Disque foliaire
- Coupez les disques foliaires (4 mm de diamètre) de plants de riz âgés de 4 à 6 semaines à l’aide d’un poinçon à biopsie avec un piston. Coupez toujours les disques de feuilles dans le tiers médian de la deuxième feuille (numéroté à partir du haut) de la motobineuse principale pour réduire la variation des données (figure 1C).
- Placez un disque foliaire dans un puits individuel d’une plaque de microtitration de 96 puits contenant 100 μL de ddH2O pendant 10 à 12 h pour le prétraitement, ce qui permet d’atténuer les réponses liées aux blessures, car celles-ci pourraient interférer avec l’induction de ROS par les PAMP (Figure 2).
note: Actionnez doucement les disques à feuilles. Ne faites pas de coupures ou de blessures supplémentaires sur les disques de l’expérience, ce qui pourrait entraîner une variation des données. L’induction des ROS se produit principalement à partir des cellules du bord coupé, car les surfaces des tissus du riz (feuilles ou gaines) sont recouvertes de couches hydrophobes. Seules les cellules des bords coupés sont en contact avec la solution d’élicitation (voir la section de discussion).
- Gardez tous les disques de feuilles flottants, avec la surface abaxiale vers le haut, dans les puits d’une plaque de microtitration pour le prétraitement de l’eau afin d’éviter les variations associées au côté des feuilles.
2. Préparation de la solution d’élicitation
- Dissoudre la poudre de L-012 dans une solution aqueuse de 20 mM (6,23 mg/mL) avec du ddH2O pour obtenir la solution mère. Ensuite, diluer la solution mère avec 50 mM de tampon Tris HCl (pH 7,5) pour obtenir la solution de travail à la concentration finale de 500 μM L-012. Conservez la solution mère congelée et diluez-la dans la solution de travail avant utilisation.
- Préparez la solution d’élicitation contenant du PAMP, du L-012 et de la peroxydase de raifort (HRP ; 10 mg/mL dans du jdH2O). Pour une solution d’élicitation de 10 mL, mélanger 9,4 mL de solution de Tris HCl (pH 7,5) à 50 mL, 400 μL de solution L-012, 100 μL de HRP et 100 μL de flg22 (PAMP ; 10 mM à jj2 O). Pour le contrôle négatif, ajouter 100 μL de ddH2O au lieu de PAMP.
note: Conservez les solutions d’élicitation préparées à température ambiante pour éviter le stress dû au froid sur les tissus du riz. D’autres PAMP peuvent également être utilisés pour le traitement au besoin, comme la chitine (20 ng/mL en concentration finale). Comme le L-012 est sensible à la lumière, couvrez tous les tubes contenant la solution de L-012 avec du papier d’aluminium.
3. Démarrage du logiciel et configuration du protocole avec le lecteur de microplaques référencé (voir Tableau des matériaux)
REMARQUE : La configuration des paramètres du logiciel de lecture de microplaques prend un certain temps. Il est recommandé de préparer la machine et le protocole (un clic pour continuer) avant d’ajouter la solution d’élicitation.
- Démarrez le logiciel. Cliquez sur le bouton Expériences pour créer un protocole ou utiliser un protocole existant.
- Cliquez sur Procédure dans la fenêtre contextuelle pour configurer la plaque. Sélectionnez les puits de la plaque à surveiller.
- Cliquez sur Start Kinetic pour configurer la durée totale d’exécution et l’intervalle de lecture. Réglez la durée d’exécution sur 35 min ou plus, en fonction des exigences expérimentales. Pour obtenir des relevés aussi fréquents que possible, sélectionnez Intervalle minimum. Pour le temps d’intégration, choisissez 1 s ou plus, en fonction de l’intensité du signal.
REMARQUE : L’intervalle de lecture dépend du nombre d’échantillons et de la durée d’intégration du signal.
- Cliquez sur Valider | OK pour confirmer les paramètres.
- Cliquez sur Détecter la nouvelle plaque dans la fenêtre contextuelle et attendez que le logiciel affiche la boîte de dialogue de la plaque de chargement. Placez la plaque à tester sur le support.
- Arrêtez-vous ici pour attendre que le système d’élicitation soit mis en place (dans la section suivante). Dès que le système d’élicitation est prêt, cliquez sur Exécuter pour lancer la lecture.
4. Mise en place du système d’élicitation et mesure de la production de ROS en temps réel
- Retirez avec précaution le ddH2O des puits contenant les tissus prétraités, en évitant toute lésion ou dessiccation des tissus.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 200 μL de la solution d’élicitation dans les puits contenant les tissus.
- Secouez doucement pour mélanger. Cliquez sur Exécuter pour lancer la détection.
note: Avec le traitement PAMP, les tissus végétaux réagissent et produisent des ROS très rapidement. Par conséquent, il est suggéré de traiter d’abord le témoin négatif sans PAMP afin de réduire le temps d’opération lorsqu’il y a plusieurs traitements. Opérer le plus rapidement possible pour réduire le délai d’élicitation entre les traitements. Plus le délai entre l’ajout de la solution d’élicitation et le début de la détection est court, meilleure sera la capture des données expérimentales importantes.
