Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique
- Obtenir du sang total humain d’un donneur sain ou d’un patient par ponction veineuse à l’aide de vacutainers contenant un anticoagulant acide-citrate-dextrose (ACD) (tubes jaunes).
note: Le sang total peut être conservé dans un ACD à température ambiante (18-22 °C) jusqu’à 36 heures avant de passer à l’étape suivante. Normalement, 1 à 2 tubes de vacutainer de 10 ml de sang total sont suffisants pour le dosage.
- Diluer le sang entier 1:1 v/v dans un milieu RPMI complet chaud (RPMI-1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 20 mM HEPES et 0,01 mg/mL de gentamicine).
- Isolez les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang total dilué à l’aide de la centrifugation à gradient de densité, comme recommandé par le fabricant (voir la liste des matériaux). Superposez très lentement le sang dilué sur le gradient de densité (réchauffé à température ambiante, 18-22 °C).
note: Minimisez la quantité de mélange à l’interface pour une séparation optimale du sang en superposant soigneusement le mélange sanguin en goutte à goutte ou en utilisant une pipette.
- Laissez le mélange sanguin se superposer lentement sur le haut du gradient de densité en plaçant l’extrémité de la pipette près du gradient de densité et en permettant au mélange sanguin de s’écouler très lentement sur le côté du tube.
- Selon l’échelle de l’expérience, superposez 10 mL de mélange sanguin sur 3 mL de gradient de densité (dans un tube de 15 mL) ou 35 mL de mélange de sang sur 15 mL de gradient de densité (dans un tube de 50 mL). En règle générale, 10 ml de sang total produisent 10 millions de PBMC, avec une certaine variation d’un donneur à l’autre.
note: Il est très important qu’il n’y ait pas de mélange du mélange sanguin avec le gradient de densité. Le mélange de sang doit se superposer sur le gradient de densité et augmenter lentement jusqu’à ce que tout le sang se trouve au-dessus du gradient de densité.
- Centrifuger le mélange stratifié à 700 x g pendant 30 min sans freins. Le mélange centrifugé doit être séparé en 5 couches (de haut en bas) : plasma, couche leucocytaire (contenant des PBMC), matériau à gradient de densité, granulocytes et globules rouges.
- Retirer et jeter la majorité du plasma et récupérer soigneusement le contenu de la couche leucocytaire (PBMC) dans un nouveau tube de 15 mL à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une poire d’aspiration.
note: L’élimination de la couche leucocytaire se fait efficacement en appliquant une aspiration sur la pipette Pasteur tout en effectuant un mouvement circulaire autour de l’extérieur de la couche, avec la pointe de la pipette contre le tube.
- Laver les PBMC isolés trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de pH 7,3 en les centrifugant à 350 x g pendant 10 minutes (avec les freins à fond) entre les lavages. Reconstituer la pastille PBMC dans un milieu RPMI complet. Selon la taille de la pastille, 3 à 7 ml de milieu suffisent.
- Comptez le PBMC à l’aide de bleu trypan et d’un hémocytomètre. Ne comptez que les cellules qui ne sont pas colorées par le bleu trypan. Reconstituer les PBMC à 1 750 000 cellules/mL dans un milieu RPMI complet.
- Semez 400 μL (700 000 cellules) dans chaque puits d’une lame à 8 chambres. Incuber la lame dans un incubateur de culture tissulaire entièrement humidifié à 37 °C (complété par 5 % de CO2) pendant 1 h pour permettre l’adhésion des monocytes/macrophages.
2. Prétraitement des monocytes collés
REMARQUE : Cette étape n’est nécessaire que si l’on cherche des moyens d’inhiber ou d’améliorer la phagocytose.
- Prétraiter les monocytes adhérents avec tout médicament ou composé d’intérêt. Reconstituez le(s) médicament(s) ou tout autre matériel d’essai à la concentration souhaitée à l’aide d’un milieu RPMI complet.
note: Par exemple, 200 μg/mL d’IgIV sont généralement utilisés pour obtenir une inhibition de 95 à 100 % de la phagocytose lors de l’utilisation de monocytes humains.
- Aspirez et jetez le surnageant contenant toutes les cellules non adhérentes de la lame à 8 chambres après l’incubation de 1 h (après l’étape 1.6). Remplacez-le par 400 μL d’un médicament ou d’un autre traitement et incubez pendant 1 h à 37 °C.
- Lors de l’aspiration et du remplacement de solutions dans la lame à 8 chambres, assurez-vous de contrôler le débit des fluides afin que les cellules faiblement adhérentes ne se décollent pas. De plus, travaillez avec seulement 2-3 puits vides à la fois et évitez de les assécher.
note: En règle générale, chaque traitement est effectué en trois exemplaires techniques.
3. Opsonisation des globules rouges R2R2
REMARQUE : Les globules rouges R2R2 opsonisés sont utilisés comme contrôle positif pour la phagocytose médiée par FcγR. Naïve R2R2 doit être conservé dans la solution d'Alsever (pour prolonger la durée de conservation) à 4 °C pendant 1 mois maximum. La solution d'Alsever est fabriquée en interne et composée de 0,8 % p/v de citrate trisodique (dihydraté), de 1,9 % p/v de dextrose, de 0,42 % p/v de chlorure de sodium et de 0,05 % p/v d'acide citrique (monohydraté). Si les cellules R2R2 ne sont pas disponibles, d’autres cellules phénotypées Rh, telles que R1R2, R1R1, R1r ou R2r, peuvent être utilisées.
- Laver les globules rouges R2R2 (cDE/cDE) dans le PBS un total de trois fois par centrifugation à 350 x g pendant 5 min chacune.
note: La quantité de globules rouges nécessaires dépend de la taille de l’expérience et peut être rétrocalculée. Lavez toujours une quantité excessive de globules rouges, car les globules rouges sont perdus à chaque lavage en raison de la lyse ou lors de l’élimination du surnageant. Par exemple, dans une expérience avec 5 traitements et 2 contrôles, tous menés en triplicats techniques, il y a un total de 21 puits. 21 puits avec 400 μL/puits de mélange de globules rouges à 1,25 % indiquent que 105 μL de globules rouges compressés et opsonisés sont nécessaires. 200 μL de globules rouges doivent être initialement lavés et 150 μL doivent être opsonisés pour s’assurer qu’il y a une quantité adéquate de globules rouges pour l’étape de phagocytose.
- Opsoniser la pastille lavée R2R2 avec des anticorps polyclonaux anti-D 1:1 v/v provenant de sérum humain et incuber pendant 1 h à 37 °C, avec mélange intermittent.
note: Si l’on ne dispose pas d’anticorps polyclonaux anti-D, il est possible d’utiliser des anticorps monoclonaux anti-D, qui sont disponibles dans le commerce, ou des anticorps anti-D qui sont normalement utilisés pour la prophylaxie immunitaire Rh, qui peuvent être obtenus auprès de banques de sang ou de services de transfusion. Des tests d’optimisation doivent être effectués au début de la mise en place du test, et chaque fois que vous changez de lot d’anticorps polyclonaux non titrés ou que vous passez à un anticorps monoclonal. Il s’agit d’identifier la concentration ou le volume optimal d’anti-D requis pour un résultat de test d’antiglobuline (IAT) compris entre 3+ et 4+ et un résultat de phagocytose compris entre 70 et 90 globules rouges phagocytés pour 100 monocytes comptés.
- Laver le R2R2 opsonisé au total trois fois dans du PBS en utilisant la centrifugation à 350 x g pendant 5 min chacune.
note: L’opposition réussie de R2R2 peut être confirmée en effectuant un IAT indirect. En bref, des anticorps polyclonaux polyclonaux anti-humains secondaires sont ajoutés pour se lier aux anticorps opsonisants primaires à la surface des globules rouges, et le signal amplifié peut être observé sous forme d’hémagglutination. Un protocole détaillé du fabricant se trouve dans le dossier des matériaux supplémentaires.
- Reconstituer la pastille lavée R2R2 à 1,25 % v/v à l’aide d’un milieu RPMI complet.
note: L'excès de R2R2 peut être stocké dans la solution d'Alsever à 4 °C pendant une semaine au maximum.
4. Phagocytose médiée par le récepteur Fc
- Aspirer le médicament ou le surnageant moyen de la lame à 8 chambres et ajouter 400 μL du mélange R2R2 à 1,25 % v/v. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
- Après 2 h d'incubation, retirez les chambres à l'aide des adaptateurs du fabricant. Tamponnez l’excédent de R2R2 sur un essuie-tout. Assurez-vous que la diapositive ne se dessèche pas.
- Remplissez un bécher de 100 ml de PBS. Immergez et lavez la lame en la déplaçant lentement d’avant en arrière (environ 30 à 40 coups) pour éliminer la majorité du R2R2 non phagocyté.
- Retirez la diapositive du PBS. Tamponnez l’excès de PBS à l’aide d’une serviette en papier ou d’un mouchoir en papier et séchez la lame à l’air.
- Fixez la lame séchée à l’air dans 100 % de méthanol pendant 45 s. Ensuite, faites sécher à l’air libre la diapositive fixe.
note: Les lames peuvent être fixées à l’aide d’une autre méthode plus compatible avec la coloration en aval, comme la coloration Grünwald-Giemsa21 ou la coloration Wright-Giemsa.
- Montez la glissière à l’aide d’un support de montage Elvanol fabriqué en interne (ou d’un autre support de montage disponible dans le commerce) et ajoutez-le.
note: Le support de montage Elvanol est composé de 15 % p/v de résine d’alcool polyvinylique et de 30 % v/v de glycérine dans du PBS. Le mélange est chauffé jusqu’à ce que toute la résine soit dissoute et que la glycérine soit mélangée de manière homogène. Il peut être remplacé par d’autres supports de montage disponibles dans le commerce.
- Laissez le support sécher pendant la nuit avant de quantifier.
5. Quantification de la phagocytose
- À l’aide d’un microscope à contraste de phase et d’un objectif 40X, quantifiez manuellement la quantité d’événements phagocytaires en comptant au moins 200 monocytes et le nombre de R2R2 phagocytés au sein de ces monocytes. Ayez un compteur dans chaque main pour quantifier simultanément le nombre de monocytes et le nombre de R2R2 phagocysés.
- Obtenir l’indice phagocytaire moyen en divisant le nombre de R2R2 phagocytés par le nombre de monocytes et en multipliant par 100. Exprimer les données sous forme de moyenne (indice phagocytaire moyen) ± d’erreur type de la moyenne (SEM).
