Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation
- Liquide de lavage
- Préparez une solution saline équilibrée avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 100 μM.
note: Pour mesurer les niveaux de protéines dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL), il est recommandé d’ajouter des inhibiteurs de protéase pour empêcher l’activité de la protéase dans le liquide BAL.
- cathéter
- Fabriquez un cathéter en insérant une aiguille de 23 G dans un tube en plastique transparent en polyéthylène 21 G (diamètre intérieur : 0,58 mm, diamètre extérieur : 0,965 mm et longueur : 0,5 cm). Des cathéters préfabriqués peuvent également être utilisés.
- Anesthésiques
- Préparez un anesthésique terminal, de préférence un anesthésique qui provoque un arrêt respiratoire (par exemple, une solution de barbiturique comme le pentobarbital sodique (>100 mg/kg) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)).
note: Il est recommandé d’utiliser une anesthésie injectée au lieu d’une anesthésie inhalée, car l’anesthésie inhalée peut influencer la teneur en liquide BAL. Le CO2, par exemple, a une influence sur le pH du sang et par conséquent sur la redistribution des différents composés.
- Tampon de lyse des globules rouges à base d’ammonium-chlorure de potassium (ACK)
- Préparez un tampon de lyse ACK en dissolvant 8,29 g de chlorure d’ammonium (NH4Cl) et 1 g de bicarbonate de potassium (KHCO3) dans 1 L de H2O avec 100 μM d’EDTA ; le tampon de lyse des globules rouges peut également être acheté auprès d’une source externe.
2. Réalisation du Lavage Broncho-alvéolaire (BAL)
- Introduction du cathéter dans la trachée
- Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’un anesthésique barbiturique à courte durée d’action à l’aide d’une aiguille de 26 G. Pour confirmer la bonne anesthésie létale, pincez la patte arrière de la souris avec une pince pour vérifier le réflexe du pied.
- Placez l’animal sur le dos sur une plaque chirurgicale et fixez la souris en épinglant les membres.
- Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur le cou pour désinfecter. Faites une incision dans la peau du cou près de la trachée à l’aide d’un scalpel.
- Ouvrez la peau pour exposer les glandes salivaires. Séparez les glandes salivaires à l’aide de pinces pour exposer le muscle sterno-hyoïde. Incisez le muscle autour de la trachée à l’aide de pinces pour exposer la trachée.
- Placez un fil de coton sous la trachée à l’aide d’une pince.
- Percez soigneusement le milieu de la trachée exposée entre deux anneaux cartilagineux avec une aiguille de 26 G. Veillez à ne pas endommager davantage la trachée.
- Insérez le cathéter à environ 0,5 cm dans la trachée. Assurez-vous que le cathéter n’est pas inséré trop bas dans la trachée, car cela peut entraîner des dommages à la structure pulmonaire.
- Stabilisez le cathéter en attachant la trachée autour du cathéter à l’aide du fil de coton placé à l’étape 2.1.5. Si le cathéter n’est pas suffisamment attaché, la solution saline équilibrée injectée peut s’écouler vers la partie supérieure des voies respiratoires au lieu de descendre dans les poumons.
- Recueillir le liquide de lavage
- Chargez une seringue de 1 mL avec 1 mL de solution saline équilibrée stérile avec 100 μM d’EDTA.
- Connectez la seringue de 1 mL au cathéter et injectez doucement la solution de sel/EDTA dans les poumons.
- Aspirez doucement la solution tout en massant le thorax de la souris. Si le liquide d’aspiration n’est pas visible dans la seringue, insérez soigneusement le cathéter un peu plus bas ou plus haut dans la trachée.
- Retirez la seringue de l’aiguille et transférez le liquide de lavage récupéré dans un tube de 15 mL placé sur de la glace. Normalement, 700 à 900 μL de BAL sont récupérés à partir de 1 mL de solution injectée.
- Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.4 deux fois de plus.
note: Si le but est d’analyser le contenu non cellulaire, il est recommandé de concentrer les échantillons groupés lorsqu’il y a des problèmes de sensibilité.
3. Collecte des composants cellulaires et non cellulaires du liquide BAL
- Centrifuger le liquide de lavage pendant 7 min à 400 x g et 4 °C.
- Prélever le surnageant et l’utiliser immédiatement pour une analyse plus approfondie (p. ex., dosage immuno-enzymatique, ELISA) ou le congeler à -80 °C. Conservez la pastille cellulaire pour analyser l’afflux cellulaire dans les poumons.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de lyse ACK.
note: Cette étape assure la lyse des érythrocytes tout en gardant les globules blancs intacts.
- Incuber 2 min à RT.
note: Pour réduire la variation causée par la lyse des globules rouges, cette étape ne doit pas être effectuée pendant plus de 2 minutes.
- Ajouter 1 mL de PBS froid pour diluer le tampon de lyse ACK.
- Centrifuger pendant 7 min à 400 x g et 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un volume adéquat de PBS pour l’analyse en aval (voir ci-dessous).
note: Le volume de l’EBP dépend de l’étude en aval qui sera réalisée.
4. Analyse des différents types de cellules dans le liquide BAL par cytométrie en flux
REMARQUE : Une possibilité est d’analyser la composition cellulaire absolue et relative du liquide BAL en effectuant une cytométrie en flux. L’objectif de cet article est de développer la technique de la LBA. La cytométrie en flux est une technique spécialisée à part entière. Il est recommandé de lire des articles spécialisés sur la technique de cytométrie en flux. On utilise des anticorps couplés à un fluorophore qui reconnaissent les antigènes de surface (voir tableau 1) spécifiques à un ou plusieurs types de cellules particuliers. En utilisant une stratégie de gating, il est possible d’identifier les lymphocytes T, les macrophages, les cellules dendritiques, les lymphocytes B, les éosinophiles et les neutrophiles dans la fraction cellulaire du BAL.
- Coloration de la surface cellulaire
note: Il est important d’inclure tous les contrôles critiques pour l’analyse par cytométrie en flux. Trois séries de tubes sont nécessaires (voir tableau 2) : (1) des tubes contenant les échantillons ; (2) tubes avec des cellules BAL pour chaque anticorps-fluorophore afin de faire des colorations uniques ; Cela permet de déterminer les tensions pour chaque canal sur le cytomètre en flux ; et (3) des tubes avec des billes pour chaque anticorps-fluorophore afin de faire des colorations uniques ; Il s’agit de déterminer la matrice de rémunération.
- Faire un mélange des anticorps et du bloc Fc (anti-CD16/CD32) dans le PBS aux dilutions appropriées (voir tableau 2). Il est nécessaire de déterminer la dilution de travail optimale pour chaque anticorps avant l’expérience.
- Remettre les cellules en suspension dans 50 μL du mélange d’anticorps pour l’échantillon et ajouter 50 μL de l’anticorps correctement dilué aux témoins critiques.
note: La coloration peut être effectuée dans une plaque en forme de U de 96 puits. Cela permet de réduire facilement le volume de teinture et d’analyser des quantités importantes d’échantillons.
- Incuber 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
- Centrifuger pendant 7 min à 400 x g et 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans le PBS jusqu’à un volume final de 200 μL.
note: Ce volume final dépend du volume minimal auquel le cytomètre en flux peut accéder. Cela peut différer légèrement d’une machine à l’autre. De plus, le volume lu dépend du nombre de cellules et/ou du temps que l’échantillon mettra à fonctionner dans le cytomètre en flux.
- Utiliser les échantillons et les témoins pour l’analyse cytométrique en flux.
note: Pour déterminer le nombre absolu de cellules des différentes populations de cellules, il faut ajouter des billes de comptage. Ajoutez le même nombre de billes (± 25 000 billes) à chaque échantillon juste avant la mesure. En utilisant la diffusion vers l’avant et sur le côté, les billes de comptage peuvent être identifiées par cytométrie en flux (voir Figure 1). Par la suite, le nombre absolu de cellules dans l’échantillon peut être calculé en comparant le rapport entre les événements de billes et les événements de cellule. La formule suivante peut être utilisée :
Tableau 1 : Sélection des antigènes de surface des cellules immunitaires. Ce tableau fournit une liste des épitopes de surface utilisés pour caractériser les différents types de cellules. Des combinaisons de plusieurs marqueurs seront nécessaires pour définir de manière fiable un type de cellule spécifique.
| antigène | Type de cellule |
| Cluster de différenciation 3 (CD3) | Exprimé sur les lymphocytes T |
| Cluster de différenciation 11c (CD11c) | Forte expression sur la plupart des cellules dendritiques, mais aussi sur les monocytes, les macrophages, les neutrophiles et certains lymphocytes B. |
| Cluster de différenciation 11b (CD11b) | Exprimé à la surface de nombreux leucocytes, y compris les monocytes, les neutrophiles, les cellules tueuses naturelles, les granulocytes et les macrophages. |
| SiglecF | Macrophages alvéolaires et éosinophiles. |
| MHCII | Normalement, on ne le trouve que sur les cellules présentatrices d’antigènes telles que les cellules dendritiques, les phagocytes mononucléaires et les cellules B. |
| CD19 | Antigène des lymphocytes B |
| Ly-6G | Un marqueur pour les monocytes, les granulocytes et les neutrophiles |
Tableau 2. Liste des contrôles à inclure. Ce tableau présente tous les contrôles nécessaires à l’interprétation précise des résultats obtenus.
| Échantillons | | | | |
| tube | Antigène-fluorophore à ajouter aux cellules | Concentration du stock d’anticorps (mg/mL) | Dilution des anticorps | Volume total (μL) |
| Colorant de viabilité fixable | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| échantillon X | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Contrôles de tension | | | | |
| tube | Antigène-fluorophore à ajouter aux cellules | Concentration du stock d’anticorps (mg/mL) | Dilution des anticorps | Volume total (μL) |
| Cellules non colorées | / | / | / | 50 |
| Cellules monocolorées | Colorant de viabilité fixable | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| Cellules monocolorées | CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| Cellules monocolorées | SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| Cellules monocolorées | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Cellules monocolorées | CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Cellules monocolorées | CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Cellules monocolorées | CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Cellules monocolorées | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Contrôles de compensation | | | | |
| tube | Antigène-fluorophore à ajouter aux billes | Concentration du stock d’anticorps (mg/mL) | Dilution des anticorps | Volume total (μL) |
| Perles non teintées | / | / | / | 200 |
| Perles monochromes | CD11c | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perles monochromes | SiglecF | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perles monochromes | MHCII | 0,2 | 1/200 | 200 |
| Perles monochromes | CD3 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perles monochromes | CD19 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perles monochromes | CD11b | 0,2 | 1/400 | 200 |
| Perles monochromes | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 200 |
Tableau 3 : Vue d’ensemble des lasers et des filtres du cytomètre en flux utilisés dans cette étude.
| Type laser | Configuration du filtre | |
| 505 LP | Référence 525/50 |
| Bleu (488 nm) | 550 disques vinyles | Référence 575/26 |
| 100 mW | 670 LIVRES LITRES | 685/35 |
| 750 LIVRES OLÉAIRES | 780/60 |
| Violet 405 NM | | 450/50 |
| 100 mW | | |
| Rouge 633 NM | | Référence 660/20 |
| 70 mW | 750 LIVRES OLÉAIRES | 780/60 |
