1. Configuration des tests MIC90 répliquants et non réplicatifs
- Inoculer M. tuberculosis, M. bovis BCG ou M. smegmatis à une DO580 de 0,01-0,1 et étendre jusqu’à la phase mi-logarithmique (DO580 ~ 0,5) dans Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contenant 0,2 % de glycérol, 0,2 % de dextrose, 0,5 % d’albumine et 0,085 % de NaCl) ou 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contenant 0,2 % de glycérol et 10 % de supplément d’OADC).
- Cultiver M. tuberculosis et M. bovis BCG sous forme de cultures sur pied de ~20 ml dans des flacons de culture cellulaire et M. smegmatis en agitant dans des tubes à centrifuger coniques en polypropylène à fond rond (culture de 4 ml) ou de 50 ml (culture de 10 à 20 ml). Incuber des mycobactéries pathogènes à 37 °C avec 20 % d’O2 et 5 % de CO2, et M. smegmatis à 37 °C avec 20 % d’O2.
- Mettre en place une expérience de type MIC90 (concentration minimale inhibitrice) dans des conditions de réplication et de non-réplication (Figure 1).
note: Les agents d’essai sont généralement dosés en doubles ou en quadruples pour permettre d’analyser respectivement 4 ou 2 composés par microplaque à 96 puits. Par exemple, dans une plaque à 96 puits, un agent d’essai peut être analysé dans les rangées A-D et un autre dans les rangées E-H. Le DMSO (véhicule) se trouve dans les colonnes 1, 2 et 12, et la série de dilution de l’agent d’essai va de la colonne 3 (concentration la plus faible) à la colonne 11 (concentration la plus élevée). Les dosages de type MIC90 utilisent généralement une série de dilution 2 fois. Il existe de nombreux modèles non réplicatifs disponibles pour les mycobactéries et, à des fins d’illustration, nous utilisons un modèle de non-réplication à stress multiple.
- Pour le test de réplication, répartir 200 μl de cellules dans 7H9-ADN à une DO580 de 0,01 dans tous les puits d’une plaque à 96 puits à fond clair et traitée par culture tissulaire.
- Pour l’essai non réplicatif, laver les cellules deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,02 % de tyloxapol, et remettre les cellules en suspension dans un milieu non réplicatif (0,05 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4, 0,005 % citrate d’ammonium ferrique, 0,0001 % ZnCl2, 0,1 % NH4Cl, 0,5 % BSA, 0,085 % NaCl, 0,02 % tyloxapol, 0,05 % butyrate ; pH ajusté à 5,0 avec 2 N NaOH).
- Diluez les cellules à une DO580 de 0,1 dans un milieu non réplicatif et ajoutez du NaNO2 à partir d’un stock de 1 M fraîchement préparé à une concentration finale de 0,5 mM.
- Répartir des cellules de 200 μl à une DO580 de 0,1 dans tous les puits d’une plaque à 96 puits à fond transparent et traitée par culture tissulaire.
note: Préparer les dilutions composées sous forme de solutions mères 100 fois supérieures dans du DMSO. Ainsi, une plaque de CMI typique testant l’impact d’une molécule à une concentration finale de 0,4 à 100 μg/ml nécessiterait des solutions mères de 0,04 à 10 mg/ml dans du DMSO.
- Ajouter 2 μl de dilutions de l’agent d’essai 1 dans les rangées A-E et 2 μl de dilutions de l’agent d’essai 2 dans les rangées E-H. Mélanger.
- Ajouter 2 μl de commande de véhicule (généralement DMSO) dans les puits de contrôle, colonnes 1, 2, 12 (rangées A-H). Mélanger.
- Pour chaque expérience, inclure au moins un témoin positif tel que la rifampicine de 0,004 à 1 μg/ml (test de réplication) et/ou de 0,08 à 20 μg/ml (test de non-réplication).
note: L’utilisation de la 6-bromo-1H-indazol-3-amine9 à des doses de 0,1 à 25 μg/ml est recommandée comme composé témoin ayant une activité sélective dépendante du NaNO2 dans le modèle de non-réplication à contraintes multiples.
- Pour la réplication des essais, incuber des microplaques à 37 °C à 20 % d’O2 et 5 % de CO2 pendant 7 jours (M. tuberculosis et M. bovis BCG) ou 1 à 48 heures (M. smegmatis). Pour le modèle multi-stress de non-réplication, incuber des microplaques pendant 7 jours à 37 °C à 1 % d’O2 et 5 % de CO2 (M. tuberculosis et M. bovis BCG).
2. Inoculation de microplaques CARA
- Aux moments où le CARA sera utilisé comme lecture, remettre soigneusement en suspension le contenu du puits de la plaque de dosage de type MIC90 à l’aide d’une pipette multicanaux p200 réglée à 50-75 μl. Pipeter de haut en bas au moins 5 à 10 fois et faire tourner doucement le contenu du puits dans un mouvement circulaire à l’aide des pointes de pipette.
- Transférez 10 μl du contenu du puits d’analyse dans la microplaque CARA. Assurez-vous que l’ordre du contenu du puits sur la plaque d’analyse correspond à l’ordre du contenu du puits de la microplaque CARA. Évitez les éclaboussures pendant les transferts et assurez-vous que les 10 μl sont repérés au milieu des puits de microplaques CARA. Confirmez que les 10 μl sont absorbés dans la microplaque CARA.
note: Il n’est pas nécessaire de procéder à des dilutions avant de repérer les cellules sur les microplaques CARA.
- Attachez des piles de microplaques CARA avec du ruban adhésif, puis placez-les dans un sac en plastique refermable. Incuber des microplaques CARA à 37 °C avec 20 % d’O2 (M. smegmatis) ou 1 % d’O2 et 5 % de CO2 (M. tuberculosis et M. bovis BCG).
- Pour M. tuberculosis et M. bovis BCG, tests répliquants : incuber pendant 7 jours ; pour M. tuberculosis et M. bovis BCG, incuber pendant 10 jours ; pour M. smegmatis, tests réplicatifs, incuber pendant 1 à 2 jours ; pour M. smegmatis, tests non réplicatifs, incuber 2-3 jours.
REMARQUE : Les temps sont des estimations et peuvent être modifiés en conséquence pour différentes conditions de réplication, de non-réplication et de stress.
3. Développement des microplaques CARA
- Développer les microplaques CARA lorsqu’une pellicule de croissance bactérienne, ou des colonies macroscopiques plus grandes, sont visibles sur les puits de contrôle négatifs (véhicules).
note: Après une incubation prolongée, les puits de microplaques CARA semblent souvent secs et nous recommandons de prémouiller le contenu du puits avec du PBS stérile. Cela permet d’empêcher le charbon d’absorber la résazurine, ce qui peut entraîner une faible fluorescence ou une variation d’un puits à l’autre.
- À l’aide d’un seul ensemble de 12 pointes p200 avec une pipette multicanaux, distribuez 40 μl de PBS stérile le long du côté des puits et laissez le PBS se répartir sur le dessus des microcolonies de gélose/bactéries.
- Préparez le réactif de développement CARA en mélangeant 5 mg de résazurine (0,01 % final) et 50 ml de Tween-80 à 5 % dans du PBS. Vortex et filtre stérile.
note: Un réactif de développement CARA alternatif peut être préparé en mélangeant une solution liquide de résazurine préparée commercialement à 1:1 (vol/vol) avec 10 % de Tween80 dans du PBS.
- Ajouter 50 μl de réactif de développement CARA fraîchement préparé dans chaque puits de la microplaque CARA à l’aide d’une pipette à 12 canaux. Rochez les plaques d’avant en arrière plusieurs fois pour aider à répartir les réactifs sur la gélose et le tapis bactérien dans chaque puits.
- Placez les plaques dans un sac en plastique refermable et incubez à 37 °C pendant au moins 30 min pour M. smegmatis et 45-60 min pour M. tuberculosis ou M. bovis BCG.
note: Si les puits de contrôle du véhicule ne deviennent pas roses dans la première heure, les plaques peuvent être réemballées et incubées pendant de plus longues périodes.
- Avant de lire la fluorescence, placez les microplaques CARA dans une hotte de biosécurité pendant 15 minutes à température ambiante, avec leurs couvercles retirés. Lorsque vous utilisez des spectrophotomètres BSL3 à l’extérieur d’une enceinte de biosécurité, collez un autocollant PCR de qualité optique sur la plaque et fermez-le hermétiquement en appuyant doucement sur la surface de l’autocollant avec une serviette en papier douce.
- Déterminez la fluorescence par lecture supérieure avec excitation à 530 nm et émission à 590 nm. Il n’est pas nécessaire de blanchir la plaque.
