1. Préparation des milieux et des réactifs
- Préparez le milieu de fibroblaste. Combinez 450 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline/streptomycine. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
- Préparer le milieu rapporteur de croissance des macrophages dans des aliquotes de 50 mL. Combinez 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS, 5 μg/mL de réactif d’élimination des mycoplasmes (Table des matières) et 200 μg/mL de phléomycine D1 (Table des matières). Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
- Préparer le milieu d’analyse des macrophages rapporteurs dans des aliquotes de 50 mL. Combinez 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS inactivé par la chaleur, 5 μg/mL de réactif d’élimination des mycoplasmes et 200 μg/mL de phléomycine D1. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
2. Revêtement des surfaces de culture cellulaire avec du poly(méthacrylate de méthyle)
- Dissoudre le poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA) dans du chloroforme à raison de 20 mg/mL (p. ex., 100 mg de PMMA dans 5 mL de chloroforme) dans un flacon de verre à scintillation de 20 mL. Placez un barreau d’agitation magnétique dans le flacon et laissez agir pendant au moins 2 h, jusqu’à ce que tous les solides soient dissous.
prudence: Le chloroforme est nocif s’il est inhalé. Assurez-vous d’utiliser un solvant dans une hotte tout en portant des gants PVA.
- Pipeter 400 μL de solution de PMMA au centre d’une lame de microscope en verre borosilicaté dans une machine à doser, et faire tourner à 3000 tr/min pendant 2 min. Préparez le nombre de lames requis pour le dosage, ainsi que 3 à 5 lames supplémentaires pour la mesure de l’angle de contact avec l’eau. Conservez les lames dans une boîte propre (vaporisée et essuyée avec de l’éthanol à 70 %) pour une utilisation future.
note: Le revêtement par centrifugation est souvent utilisé pour déposer un revêtement mince et uniforme sur une surface plane. Une machine de revêtement par centrifugation fait tourner un substrat à grande vitesse, en utilisant la force centrifuge pour étaler la solution de revêtement sur la surface.
- Mesurez l’angle de contact avec l’eau à deux positions aléatoires sur la surface des lames extra revêtues (c’est-à-dire pas les lames utilisées pour la culture cellulaire) avec un goniomètre pour vous assurer que la surface du verre a été complètement recouverte du polymère.
REMARQUE : Seule l’eau de la plus grande pureté (par exemple, le verre distillé trois fois) doit être utilisée pour les mesures de l’angle de contact de l’eau.
- Dans une enceinte de sécurité biologique (BSC), fixez des puits collants à 8 chambres sur des lames recouvertes de PMMA à l’aide de pinces stériles et en suivant la technique aseptique. Appuyez fermement sur le dessus des puits collants pour vous assurer qu’ils sont solidement fixés. Incuber les lames avec des puits collants attachés à 37 °C pendant la nuit pour sécuriser l’étanchéité.
- Testez l’étanchéité des puits collants en ajoutant 200 μL d’eau de culture cellulaire (sans endotoxines) dans chaque puits. Incuber à température ambiante (RT) pendant 60 min et s’assurer qu’il n’y a pas de fuite avant de continuer. Aspirez l’eau en faisant attention de ne pas perturber le revêtement en PMMA.
- Effectuez des lavages à l’eau sans endotoxines en ajoutant 300 μL d’eau sans endotoxines dans chaque puits et en incubant pendant 1 h (trois fois), 12 h et 24 h avant l’utilisation pour éliminer tout solvant restant.
- Tester la concentration en endotoxines des lames à utiliser pour la culture cellulaire. Incuber 200 μL d’eau réactive exempte d’endotoxines (tableau des matériaux) dans un puits de chaque lame pendant 1 h. Mesurer la concentration d’endotoxines dans l’extrait à l’aide d’un test d’endotoxine chromogène (Table des matériaux).
note: Le protocole suivant est spécifique au kit de dosage des endotoxines répertorié dans la table des matériaux.
- N’utilisez que de l’eau et des consommables (c’est-à-dire des pointes de pipette, des tubes de microcentrifugation et des plaques de puits) certifiés apyrogènes (c’est-à-dire sans endotoxines) pour ce travail. De plus, toute verrerie utilisée dans la préparation des surfaces recouvertes de polymère doit être dépyrogénée à l’aide d’une stérilisation à la chaleur sèche (250 °C pendant 30 min) avant d’être utilisée. La mesure de l’endotoxine dans la solution d’extrait, comme décrit ici, peut entraîner une sous-estimation de l’endotoxine à la surface du matériau. Par conséquent, il est recommandé que, lors de l’élaboration d’un protocole d’enrobage de polymère, la réaction d’essai d’endotoxine (c.-à-d. les étapes 2.6.4 à 2.6.6 pour les échantillons d’essai [eau réactive] ou les contrôles de pointe) directement dans les puits contenant l’échantillon enrobé afin de s’assurer qu’aucune source d’endotoxine n’est introduite par inadvertance dans le système pendant le processus d’enrobage.
- Apportez tous les échantillons de test (c’est-à-dire les extraits) et les réactifs de dosage des endotoxines à RT. Reconstituez le réactif chromogène dans le tampon de dosage et l’étalon d’endotoxine dans l’eau du réactif, laissez dissoudre pendant 5 minutes et remuez doucement avant de l’utiliser. Couvrez toutes les bouteilles d’un film de paraffine lorsqu’elles ne sont pas utilisées.
- Créez une courbe de dilution standard de 5 à 8 points de l’étalon d’endotoxine allant de la limite inférieure à la limite supérieure du test en effectuant une dilution en série de l’étalon d’endotoxine dans de l’eau réactive.
- Pour contrôler l’amélioration ou l’inhibition du dosage des endotoxines dans les échantillons d’essai, préparer un contrôle positif (également appelé témoin de pointe ou échantillon enrichi) en diluant une quantité connue d’endotoxine dans une solution d’échantillon d’essai inutilisée.
note: La concentration du témoin positif doit être la même qu’une norme au milieu de la courbe standard. Si la quantité récupérée de la protéine d’endotoxine (c.-à-d. la concentration du témoin positif moins la concentration de l’échantillon d’essai non enrichi) se situe à moins de 50 à 200 % de la concentration nominale de la pointe d’endotoxine, on peut considérer que la solution d’extraction n’interfère pas de manière significative avec l’essai.
- Ajouter 50 μL d’étalons, d’échantillons ou de contrôles de pointes à chaque puits d’une plaque de 96 puits en double ou en triple. Utilisez de l’eau réactive comme témoin négatif.
- Ajouter 50 μL de réactif chromogène dans chaque puits. Ajoutez rapidement du réactif dans tous les puits. Utilisez une minuterie pour enregistrer le temps nécessaire à l’ajout de réactif à tous les puits. Recouvrez la plaque d’un sceau adhésif et incubez à 37 °C (le temps d’incubation dépend du lot et est indiqué sur le certificat d’analyse inclus dans le kit de réactifs chromogènes). Alternativement, vérifiez sur la plaque toutes les 15 minutes pendant l’incubation jusqu’à ce qu’un changement de couleur soit observé dans tous les puits standard.
- Après l’incubation, ajouter 25 μL d’acide acétique à 50 % dans chaque puits (concentration finale de 10 % d’acide acétique par puits) pour arrêter la réaction. Ajouter l’acide acétique dans le même ordre que celui dans lequel le réactif chromogène a été ajouté. Lire l’absorbance de la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque à 405 nm. Aspirer le liquide et jeter la plaque.
note: L’ajout d’acide acétique devrait prendre le même temps que celui du réactif chromogène (± 30 s).
- Stérilisez les lames par ultraviolets (UV) pendant 30 minutes avant les expériences de culture cellulaire.
3. Fabrication du lysat à partir de cellules 3T3
- Cultivez des cellules 3T3 dans plusieurs flacons T150 jusqu’à une confluence de 70 %. Pour détacher les cellules, aspirez le support, lavez la surface avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et aspirez le PBS. Ajouter 5 mL d’enzyme de dissociation cellulaire recombinante d’origine animale (Table des matières) et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min.
- Détachez les cellules en inclinant doucement le ballon d’avant en arrière. Ajouter 5 mL de PBS pour neutraliser l’enzyme recombinante utilisée pour la dissociation cellulaire. Transférez les cellules détachées des fioles dans un tube à centrifuger et mélangez par pipetage. Effectuer une numération des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant de viabilité cellulaire.
note: Une enzyme de dissociation cellulaire qui peut être neutralisée par dilution dans le PBS a été sélectionnée pour éviter l’introduction de protéines sériques dans la préparation de lysat. Si la trypsine est utilisée pour dissocier les cellules, elle doit être neutralisée avec une solution contenant du sérum, et un lavage supplémentaire de PBS doit être effectué pour réduire la quantité de protéines sériques transportées dans la préparation de lysat.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans le volume d’origine (c.-à-d. 10 mL x nombre de flacons) de PBS pour éliminer tout milieu restant. Répéter.
- Centrifugez à nouveau les cellules à 200 x g pendant 5 min et aspirez le surnageant. Ajouter le volume de PBS nécessaire pour obtenir une concentration cellulaire finale de 1 x 106 cellules/mL. Placer la solution cellulaire dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement congelé (au moins 2 h).
- Décongeler la solution cellulaire dans un bain-marie à 37 °C. Une fois complètement décongelée, remettez la solution dans le congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit totalement congelée. Répétez l’opération pour un total de 3 cycles de gel-dégel.
- Effectuer un dosage de l’acide microbicinchoninique (ACB) sur le lysat cellulaire à diverses dilutions (p. ex., 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) pour déterminer la concentration en protéines. Diluer le lysat cellulaire à une concentration protéique de 468,75 μg/mL, aliquote et stocker à -80 °C pour une utilisation future.
note: La concentration finale en protéines dans une plaque de 48 puits est de 125 μg/cm2 (sur la base de la surface d’un puits, 0,75 cm2).
- Effectuer un transfert Western pour évaluer la présence de DAMP dans le lysat (p. ex., protéine de choc thermique 60 [HSP60], boîte de groupe à haute mobilité 1 [HMGB1]) en chargeant 40 à 60 μg de protéine de lysat dans le tampon de charge sur un gel de polyacrylamide à 10 % de 1,5 mm d’épaisseur et suivre les procédures standard de transfert Western.
4. Évaluation de l’effet des couches de protéines adsorbées et des récepteurs de type Toll sur l’activité NF-κB des macrophages
REMARQUE : Pour un schéma du flux de travail expérimental et de la disposition des plaques, reportez-vous à la figure 1A et à la figure 2, respectivement.
- Cultivez les macrophages rapporteurs dans un flacon de taille appropriée jusqu’à 70 % de confluence. Aspirez le support, lavez la surface avec du PBS et aspirez le PBS. Ajouter l’enzyme de dissociation cellulaire recombinante et incuber à 37 °C pendant 8 min.
- Détachez les cellules en tapotant fermement les côtés de la fiole. Inactiver l’enzyme de dissociation cellulaire recombinante en ajoutant un volume égal de milieu de croissance (contenant 10 % de FBS). Effectuer une numération des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant de viabilité cellulaire.
note: La viabilité attendue des macrophages rapporteurs après une incubation de 8 minutes dans l’enzyme de dissociation cellulaire est de 90 %.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans le volume initial de PBS pour laver les cellules. Centrifuger à nouveau et remettre en suspension les cellules à 7,3 x 105 cellules/mL dans un milieu de dosage (contenant du FBS inactivé par la chaleur).
- Séparez la suspension cellulaire en 3 tubes différents : inhibiteur de TLR4, anti-TLR2 et non traité. Incuber des cellules avec un inhibiteur de TLR4 de 1 μg/mL pendant 60 min à l’ATR ou avec un anti-TLR2 à 50 μg/mL pendant 30 min à l’AT.
- Ajouter 200 μL de lysat, 10 % de FBS, 10 % de plasma de souris commercial (tableau des matériaux) ou un mélange des solutions protéiques dans une plaque à 48 puits (ou l’équivalent) et laisser la protéine s’adsorber à 37 °C pendant la durée souhaitée (c.-à-d. 30 min, 60 min ou 24 h). Aspirer des solutions protéiques des puits, à l’aide d’une pipette Pasteur fraîche pour chaque solution protéique, et laver les surfaces avec 250 μL de PBS pendant 5 min. Aspirer du PBS. Répétez l’opération pour un total de 3 lavages.
note: Il peut être nécessaire de commencer cette étape plus tôt dans le protocole en fonction du temps d’adsorption souhaité. Ajustez le protocole en conséquence.
- Après la période d’incubation avec l’inhibiteur de TLR4 ou l’anti-TLR2, pipeter les cellules à remettre en suspension. Ajouter 200 μL de solution cellulaire dans chaque puits.
- Pour la condition de contrôle TLR2-positif, ajouter Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) à une concentration finale de 150 ng/mL. En cas de contrôle positif TLR4, ajouter du lipopolysaccharide (LPS) à une concentration finale de 1,5 μg/mL. Incuber les cellules à 37 °C pendant 20 h.
- Prélever 20 μL de surnageant dans chaque puits et la plaque en double dans une plaque de 96 puits. Inclure trois puits de milieu de dosage de 20 μL comme contrôle de fond. Ajouter 200 μL de réactif de dosage du rapporteur SEAP dans chaque puits. Recouvrez la plaque d’un joint adhésif et incubez pendant 2,5 h à 37 °C.
note: Le temps d’incubation peut varier en fonction des conditions expérimentales et doit être optimisé pour une forte différence d’absorbance entre les puits témoins positifs et négatifs.
- Transvasez le reste du surnageant dans un tube de 1,5 mL (par puits). Centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min pour granuler les débris. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et conservez-le à -80 °C. Analysez le surnageant pour détecter la présence de cytokines pro-inflammatoires (par exemple, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), l’interleukine 6) via un test immuno-enzymatique (ELISA).
- Retirez le joint de la plaque adhésive. Lire l’absorbance de la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque à 635 nm. Aspirer le liquide et jeter la plaque.
