1. Génération de lentivirus codant pour des CAR
REMARQUE : Une fois que la construction du plasmide des cellules T du récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifique est terminée (CD47 et autres), les CAR lentiviraux sont générés par la procédure standard, en utilisant 293 cellules FT, un mélange d’emballage lentiviral et des agents de transfection (voir le tableau des matériaux) comme décrit. Par la suite, utilisez un kit d'amplification en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (RT-PCR) et un thermocycleur (voir le tableau des matériaux) pour déterminer le titre du virus en mesurant la quantité d'ARN lentiviral selon le protocole du fabricant. Il est important que toutes les procédures lentivirales soient effectuées dans le strict respect des exigences de sécurité.
- Ensemencez 15 x 10 cellulesde 6 HEK293FT dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et incubez les cellules pendant la nuit à 37 °C dans une parabole de 150 mm à l'intérieur d'un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Préparez deux tubes de 15 mL avec le complexe de transfection. Le premier tube contient de l’ADN plasmidique du vecteur lentiviral (5 μg) et un mélange d’emballage lentiviral (22,5 μg) dans 2,5 mL de solution de dilution par transfection. Le deuxième tube contient 82,5 μL de réactif de transfection dans 2,5 mL de solution de dilution de transfection (voir le tableau des matériaux).
- Pipetez le contenu du tube 1 dans le tube 2 et incubez le mélange à température ambiante pendant 15 min.
- Transférez le contenu du tube goutte à goutte dans la boîte de cellules de HEK293FT et incubez l’échantillon pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone et de CO2.
- Le lendemain, remplacez le milieu existant par 19 mL de milieu de culture DMEM frais et continuez à incuber les cellules pendant la nuit à l’intérieur de l’incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C.
- Transférez le milieu du plat dans un tube à centrifuger de 50 ml. Conservez le tube contenant le virus au réfrigérateur.
- Répétez la procédure ci-dessus, en ajoutant du DMEM frais et en le collectant à nouveau après 1 jour.
- Combinez deux collections de fluides dans un seul tube à centrifuger. Centrifuger le tube à 2 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
- Transférez la majeure partie du surnageant contenant du lentivirus dans un tube à centrifuger ultra-transparent. Laissez un volume minimum, environ 1 mL de surnageant pour éviter de déranger la pastille qui peut contenir des cellules et/ou des débris.
- Ultracentrifuger le surnageant clarifié ci-dessus à 110 000 x g pendant 100 min à 4 °C.
- Retirez le surnageant avec précaution et ajoutez délicatement 100 μL de milieu DMEM à la pastille virale au fond du tube. Laissez le tube sur de la glace pendant 15 min. Mélangez délicatement la solution et aliquote la solution de lentivirus dans des tubes stériles pré-refroidis. Conservez ces tubes de stock de virus dans un congélateur à -80 °C.
- À l'aide d'un kit RT-PCR quantitatif, déterminez le titre du lentivirus selon le protocole du fabricant, qui extrait et mesure l'ARN lentiviral.
2. Génération et expansion des cellules CAR-T
- Activer des cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) préalablement congelées (environ 1 x 106 à 2 x 106 cellules) dans 1 mL de milieu à cellules CAR-T avec un nombre égal de microbilles enrobées de CD3/CD28 (voir le tableau des matières) et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Décongeler une aliquote du stock de lentivirus sur de la glace.
- Ajouter 1 μL d’agent d’amélioration de la transduction dans le puits avec les cellules et mélanger.
- Ajoutez du lentivirus aux cellules à une multiplicité d’infection (MOI) de 5:1 et mélangez doucement. Le lendemain, répétez cette étape (24 heures après la première transduction).
- Surveillez la croissance des lymphocytes T tous les 2-3 jours. Ajouter un nouveau milieu de cellules CAR-T frais pour maintenir les cellules à une densité de 1 x 106 à 2 x 106 cellules/mL.
- Congelez les cellules CAR-T à l’aide d’un protocole standard à l’aide d’une solution de congélation (voir le tableau des matériaux).
- Décongelez les cellules CAR-T à l’aide d’une méthode standard et précultivez-les dans le milieu de cellules CAR-T pendant environ ~2-4 h avec de l’interleukine-2, de l’IL-2 (300 unités/mL) avant de les appliquer au test.
3. Détection de l’expression des CAR par cytométrie en flux
- Transférez 3 x 10 cellules T5 CAR et cellules T non transduites dans deux tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 ml.
- Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 2 min et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) contenant 1 % de sérum humain.
- Pipeter 100 μL de solution cellulaire dans deux tubes FACS en polystyrène de 5 mL et maintenir les tubes sur de la glace pendant 5 min.
- Ajouter 1 μL de chèvre biotinylée anti-souris F(ab')2 dans un tube de chaque type de cellule. Ensuite, ajoutez 2 μL de phycoérythrine, un anticorps anti-marqueur marqué au PE (voir le tableau des matériaux) dans l’autre tube de chaque type de cellule. Mélangez bien et incubez-les sur glace pendant 30 min.
- Laver les cellules avec 3 mL de tampon FACS dans chaque tube et centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min ; jeter les surnageants et le vortex très brièvement ou agiter brièvement les tubes pour remettre les cellules en suspension dans le liquide résiduel.
- Ajouter 2 μL de cellules présentatrices d’antigène (APC) anti-CD3 et 2 μL de solution d’anticorps 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (voir le tableau des matériaux) dans chaque tube. Dans le tube de cellules colorées à l'anti-F(ab')2 Ab, ajoutez 1 μL de streptavidine marquée au PE. Mélangez brièvement et incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes de plus.
- Utilisez le tampon FACS pour laver à nouveau les cellules comme décrit à l’étape 3.5 et ajoutez 200 μL supplémentaires de tampon FACS dans chaque tube.
- Utilisez la cytométrie en flux pour analyser les cellules en effectuant d’abord une vérification sur les cellules T dans un diagramme de diffusion directe ou latérale, puis en vérifiant les cellules vivantes (7-AAD-négatif) dans un graphique CD3 ou 7-AAD. La dernière étape consiste à analyser les anti-tags, anti-ScFv ou anti-F(ab')2 par rapport aux CD3.
4. Dosage de l’activité de cytolyse en temps réel (RTCA)
REMARQUE : Effectuez le test RTCA selon les conditions recommandées par le fabricant. En bref, plaquez d’abord les cellules cibles dans les puits de la plaque E, puis ajoutez les cellules CAR-T le lendemain. L’activité de cytolyse des cellules CAR-T contre les cellules cibles est surveillée en temps réel. Les lymphocytes T et les lymphocytes T simulés (lymphocytes CAR T simulés) sont utilisés comme contrôles de cellules effectrices négatives. Le protocole suivant décrit un test de puissance de cytolyse en temps réel in vitro pour des lignées cellulaires tumorales adhérentes.
- Ajoutez 100 μL de milieu de culture cellulaire cible dans chaque puits de la xCELLigence E-Plate, placez la plaque à l’intérieur de l’instrument xCELLigence et effectuez une lecture de fond. Ensuite, transférez la E-Plate dans une hotte de culture tissulaire pour l’ensemencement cellulaire.
- Utilisez un protocole standard pour trypsiniser les cellules cancéreuses cibles à partir du dispositif de culture. Transférez ensuite les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml et ajoutez un milieu de culture frais, jusqu’à 15 ml. Granuler les cellules par centrifugation pendant 5 min à 200 x g. Jetez le surnageant, ajoutez 5 ml de milieu frais et utilisez une pipette sérologique pour remettre doucement la pastille cellulaire en suspension. Comptez la densité des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope.
- Ajustez la densité cellulaire de manière appropriée, puis ajoutez 100 L de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque E. Le nombre cible de cellules est généralement d’environ 10 000 cellules/puits pour les lignées cellulaires adhérentes (BxPC3, Hela-CD19 et SKOV3), ou de 30 000 cellules/puits pour les cellules en suspension telles que Raji (voir ci-dessous pour plus de détails sur le pré-enrobage des puits avec des anticorps afin d’attacher les cellules cancéreuses liquides).
- Équilibrez la E-Plate à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se déposer uniformément au fond du puits (c’est essentiel ; ne sautez pas cette étape).
- Placez l’E-Plate dans l’instrument xCELLigence à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire et commencez à mesurer automatiquement l’impédance, affichée sous forme d’indice cellulaire en fonction du temps, toutes les 15 minutes.
- Le lendemain, préparez des cellules CAR-T effectrices. Assurez-vous de préparer à l’avance les contrôles appropriés (c’est-à-dire des cellules CAR-T fictives, des cellules T de contrôle non transduites et/ou des cellules CAR-T non apparentées) à l’avance pour vous assurer que toutes les cellules sont prêtes en même temps. Ajustez les cellules effectrices et les cellules de contrôle à la bonne densité, et préparez des dilutions en série pour garantir que les rapports E :T souhaités seront atteints lorsque 100 μL de suspension de cellules effectrices sont ajoutés à chaque puits à l’étape 9.
- Interrompez l’acquisition des données xCELLigence et amenez la E-Plate de l’incubateur à une hotte de culture cellulaire.
- Retirer 100 μL de milieu de chaque puits. La quantité de milieu résiduel dans chaque puits est maintenant de 100 μL.
- Ajoutez 100 μL de cellules CAR T effectrices diluées en série ou d’autres cellules de contrôle (c’est-à-dire des cellules CAR T fictives) pour obtenir les rapports E :T souhaités.
- Équilibrez la E-Plate à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre aux cellules effectrices de se stabiliser, puis replacez la E-Plate dans l’instrument xCELLigence. Acquisition de données de CV.
- Si vous le souhaitez, à des moments clés, l’acquisition des données xCELLigence peut être interrompue et la plaque retirée afin de collecter de petits échantillons à analyser par des tests orthogonaux (c’est-à-dire mesurer la production de cytokines par test immuno-enzymatique (ELISA) ou cytométrie en flux).
- Dans l’expérience EGFR-GITR-CD3 CAR T-cell, mesurez le rendement en interféron-gamma (IFNγ) à l’aide d’un kit ELISA (suivez les instructions du fabricant ; voir la table des matériaux).
note CONCERNANT L’UTILISATION DE CANCERS LIQUIDES : Pour tester les cellules cancéreuses hématologiques non adhérentes, avant d’ajouter des cellules, les puits de la plaque E sont d’abord recouverts d’un anticorps spécifique d’un antigène exprimé à la surface des cellules cancéreuses. Pour la lignée cellulaire Raji B, un réactif d’attache à base d’anti-CD40 est utilisé (voir le kit de test de destruction de tumeurs liquides dans la Table des matériaux). Voici la procédure de revêtement de la plaque :
- Diluer le réactif d’attache (anti-CD40) avec un tampon d’attache à une concentration de 4 μg/mL.
- En travaillant à l’intérieur d’un capot de culture tissulaire, ajoutez 50 μL du réactif d’attache dilué dans chaque puits de la plaque E. Laissez la E-Plate à température ambiante ou dans un incubateur à 37 °C pendant 3 h.
- Retirez le réactif de connexion et lavez la E-Plate au moins 2 fois avec un tampon de lavage. À ce stade, la E-Plate est prête pour l’ensemencement des cellules cibles Raji (30 000 cellules/puits).
- Passez à l’étape 4.1 (ci-dessus) pour effectuer le reste de la procédure.
