Méthode in vitro pour déterminer l’activité anti-apoptotique d’anticorps contre le TNFα

Résumé

Source : Tierrablanca-Sánchez, L., et al. Détermination de la puissance relative d’un anticorps monoclonal anti-TNF (mAb) par neutralisation du TNF à l’aide d’une méthode bioanalytique in vitro. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente une technique d’évaluation de l’efficacité des anticorps contre le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), une cytokine inflammatoire, grâce à une approche bioanalytique in vitro. Le TNFα, lorsqu’il est introduit dans les cellules stressées, déclenche l’apoptose. Cependant, la liaison aux anticorps confine le TNFα, évitant ainsi l’apoptose. Le degré d’apoptose est quantifié à l’aide d’un test de bioluminescence.

Protocole

1. Préparation des milieux et des solutions

1. Préparez le milieu de culture : RPMI-1640 avec 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS), pH 7,4.
2. Préparez le milieu de culture d’essai : RPMI-1640 sans rouge de phénol mais avec 1 % de FBS, pH 7,4.
3. Préparez la solution de lavage cellulaire : solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) sans Mg et Ca de Dulbecco avec 0,02 % d'EDTA, pH 7,4.
4. Préparez une solution de détachement cellulaire : 0,125 % de trypsine avec 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   1. Décongeler 100 mL d’une solution à 0,25 % de trypsine-EDTA et transférer dans une fiole stérile de 500 mL.
   2. Mélanger avec 100 mL de solution de lavage cellulaire et distribuer 15 mL d’aliquotes dans des tubes stériles de 15 mL. Conserver à une température de -70 à -80 °C jusqu’à utilisation.
   3. Filtrer ces solutions à travers une membrane de 0,22 μm et les réchauffer à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant de les utiliser.
5. Préparer une solution mère d’apoptose-induction de TNFα à 3,3 μg/mL.
   1. Dissoudre 20 μg de TNFα avec 500 μL d’eau stérilisée par filtre dans son récipient primaire et mélanger jusqu’à dissolution complète.
   2. Transvasez dans un tube stérile de 15 ml et ajoutez 5,5 ml de solution sans DPBS Mg et Ca dans ce tube. Mélangez doucement à l’aide d’un mélangeur vortex.
   3. Aliquote la solution en portions de 70 μL. Verser chaque aliquote dans des microtubes de 0,5 mL et conserver à -80 °C.
6. Préparer la solution d’induction de l’apoptose : solution de TNFα à 40 ng/mL.
   1. Décongeler une aliquote de la solution mère d’induction de l’apoptose et la faire incuber dans un bain-marie à 25 °C pendant 10 min.
   2. Diluer la solution mère d’induction de l’apoptose à 40 ng/mL en ajoutant 61 μL de solution de TNFα à 3,3 μg/mL à 4,939 mL de milieu de culture d’essai dans un tube stérile de 15 mL.
   3. Mélanger avec un mélangeur vortex pendant 10 secondes ; cette solution doit être préparée fraîchement avant utilisation.
   4. Réchauffer la solution à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser dans le test de neutralisation.
7. Préparez la solution de substrat : solution de caspase 3/7 Glo.
   1. Décongeler la solution tampon de caspase (tampon caspase 3/7 Glo) pendant 12 heures avant utilisation.
   2. Laissez la solution tampon de caspase et le substrat (substrat de caspase 3/7 Glo) reposer séparément à 25 ± 5 °C pendant 30 minutes avant de mélanger.
   3. Transvaser 10 mL de la solution tampon de caspase dans le flacon de substrat et mélanger par inversion.
   4. Conserver à 25 ± 5 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation.
      note: La solution est stable pendant 6 h à température ambiante.

2. Culture et comptage des cellules

1. Décongélation cellulaire et première sous-culture.
   1. Retirez un flacon contenant des cellules WEHI 164 d’un congélateur à -80 °C et transférez-le dans un bain de glace.
   2. Pipeter de haut en bas avec 1 mL de milieu de culture préchauffé jusqu’à ce que les cellules congelées dégèlent complètement.
   3. Verser 9 mL de milieu de culture préchauffé dans un tube stérile de 15 mL.
   4. Transférez la suspension cellulaire dans le tube stérile de 15 mL et mélangez doucement cinq fois par inversion.
   5. Centrifuger la suspension cellulaire à 125 x g pendant 3 min. Jeter le surnageant et désagréger la pastille cellulaire.
   6. Ajouter 5 ml de milieu de culture dans le tube. Mélangez jusqu’à ce que les cellules soient complètement remises en suspension.
   7. Pour le comptage cellulaire, transférez 50 μL de la suspension cellulaire dans un microtube de 500 μL et mélangez avec 50 μL de bleu de trypan à 0,4 %. Comptez les cellules et ajustez-les à 0,5 x 10⁶ cellules/ml. Voir l’étape 2.2 ci-dessous.
   8. Ajouter 13 ml de milieu de culture préchauffé dans une fiole de culture cellulaire de 75 ml.
   9. Distribuer un volume de suspension cellulaire suffisant à partir de l’étape 2.1.6 pour obtenir 0,5 x 10⁶ cellules/mL dans le ballon de culture cellulaire et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
2. Comptage des cellules.
   1. À l’aide de la solution de l’étape 2.1.6, transférez 0,05 mL dans un hémocytomètre et déterminez la densité cellulaire au microscope en utilisant l’exclusion du bleu de trypan.
   2. Quantifiez le nombre total de cellules et de cellules viables.
   3. Ajustez les suspensions de cellules à 0,5 x 10⁶ cellules/mL.
      V_{milieu de culture}(mL) = 3. Préparation et dilutions des anticorps
      1. Quantification des mAbs.
         1. Déterminer la concentration de la substance de référence, de l’échantillon témoin et de l’échantillon analytique par absorption UV à 280 nm à l’aide de leur coefficient d’extinction de masse (1,39).
            note: Les concentrations originales pourraient être tirées des étiquettes des produits pharmaceutiques. Cependant, cela doit être vérifié par l’absorption des UV.
      2. dilutions d’anticorps monoclonaux.
         1. Diluer tous les échantillons indépendamment en trois exemplaires, avec une solution sans DPBS sans Mg et sans Ca dans des microtubes de 2 ml, jusqu’à 2 mg/mL. Confirmez cette concentration par absorption UV en trois exemplaires, en utilisant une solution sans DPBS Mg et Ca comme blanc.
         2. Mélangez les solutions protéiques mères pendant 5 secondes à l’aide d’un mélangeur vortex.
         3. Diluer 100 μL de chaque solution d’AcM à 2 mg/mL avec 0,9 mL du milieu de culture d’essai.
         4. Mixez pendant 5 s avec un mélangeur vortex.
            note: Ces solutions ont une concentration de 200 μg/mL. Des dilutions doivent être faites pour chaque triple.
         5. Diluer 10 μL de chaque solution d’AcM à 200 μg/mL avec 0,99 mL du milieu de culture d’essai. Mélangez pendant 5 s à l’aide d’un mélangeur vortex. Ces solutions ont une concentration de 2 μg/mL. Effectuez des dilutions en série pour chaque triplicat avant de les utiliser dans le test de neutralisation.
         6. Effectuer des dilutions d’anticorps monoclonaux anti-TNFα dans trois microplaques indépendantes. Faites un double de chaque triplet indépendant et distribuez-les dans une microplaque, comme indiqué dans le tableau 1. Substance de référence
         7. Effectuer des dilutions d’anticorps monoclonaux de chaque référence, échantillon ou contrôle, comme indiqué dans le tableau 2.
            note: Les concentrations d’anticorps monoclonaux anti-TNFα décrites dans ce tableau ne sont pas les concentrations finales dans l’essai de neutralisation.
         8. Maintenez les plaques à 25 ± 5 °C jusqu’à utilisation.

      4. Dosage de la neutralisation avec les cellules WEHI 164

      1. Mélanger par vortex toutes les suspensions de cellules (0,5 x 10⁶ cellules/mL) avant la distribution à n’importe quelle étape de ce protocole.
         note: Dans cette section, réchauffez chaque solution à 37 °C pendant 30 minutes avant de l’utiliser.
      2. Transférez 50 μL de la suspension cellulaire dans chacun des 60 puits des microplaques, en passant de la colonne 2 à la colonne 11 et de la ligne B à G.
      3. Transférez 50 μL de dilutions de référence, d’échantillon et de contrôle dans des microplaques. Suivez le modèle illustré à la figure 1.
      4. Ajouter 50 μL de la solution d’induction de l’apoptose dans chaque puits.
      5. Utilisez des commandes cellulaires de 50 μL de cellules WEHI 164, distribuées dans trois puits. Amener chaque puits à un volume final de 150 μL avec un milieu de culture d’essai.
      6. Utiliser un contrôle de cytotoxicité d’un mélange de 50 μL de cellules WEHI 164 et de 50 μL de solution d’induction de l’apoptose. Amener chaque puits à un volume final de 150 μL avec un milieu de culture d’essai.
      7. Pour le contrôle TNFα, utiliser 50 μL de la solution d’induction de l’apoptose et la porter à 150 μL avec le milieu de culture d’essai.
      8. Pour le blanc, utiliser 150 μL de milieu de culture d’essai seul.
      9. Remplissez les puits restants avec 150 μL de milieu de culture pour éviter les effets d’évaporation des plaques.
      10. Répétez deux fois les étapes 4.1.1 à 4.1.9 dans deux autres microplaques.
          note: Les concentrations finales d’anticorps monoclonaux dans la microplaque sont les suivantes : 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 et 0,004 μg/mL.
      11. Chargez les échantillons dans des microplaques, comme indiqué à la figure 1
      12. Incuber les trois plaques à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 16 ± 2 h.
      13. Laisser reposer le réactif caspase 3/7 Glo à 25 ± 5 °C pendant 30 min avant utilisation.
      14. Ajouter 100 μL de ce réactif dans tous les puits, y compris les échantillons et les témoins.
      15. Agitez les plaques à l’aide d’un mélangeur vortex à microplaques pendant 3 min à 25 ± 5 °C immédiatement après avoir distribué dans les puits.
      16. Incuber les plaques pendant 2,5 ± 0,5 h à 25 ± 5 °C, à l’abri de la lumière.
      17. Insérez les microplaques dans le luminomètre et terminez la section suivante.

      5. Analyse des résultats

      1. À l’aide d’un logiciel de détection de luminescence, sélectionnez le mode de luminescence et la fonction de point final.
      2. Sélectionnez une plaque à fond transparent de 96 puits et ses 80 puits internes, à l’exclusion des colonnes 1 et 12.
      3. Sélectionnez un temps d’intégration de 1 250 ms et 10 s pour le mélange de la microplaque avant la lecture.
      4. Sélectionnez les puits où la substance de référence, la substance analytique et l’échantillon de contrôle seront placés et identifiez-les avec leurs concentrations correspondantes.
      5. Lisez les échantillons placés dans les microplaques à l’aide du luminomètre.
      6. Utilisez une équation à quatre paramètres pour l’analyse des résultats. Graphique d’une courbe dose-réponse, comme le montre la figure 2.
         REMARQUE : Dans l’équation du quatrième paramètre, C est la concentration effective 50 (CE50). Cette valeur sera utilisée pour comparer la substance de référence, l’échantillon analytique et l’échantillon témoin au moyen de la fonction effectrice.
      7. Pour calculer les puissances relatives, fixer la substance de référence à 100 %, calculer les puissances de l’échantillon et contrôler en conséquence.
         note: Ces valeurs sont illustrées à la figure 3.

      Tableau 1 : Réseaux d’échantillons de microplaques. Un test de neutralisation complet doit être effectué dans trois microplaques aux coordonnées B2 à G11. La distribution aléatoire d’échantillons de référence, d’analyse et de contrôle permet aux chercheurs de vérifier tout biais dans le test.

      Planche 1		Planche 2		Planche 3
      Wells	échantillon	Wells	échantillon	Wells	échantillon
      B2 :B11	Substance de référence	B2 :B11	Exemple de contrôle	B2 :B11	Échantillon analytique
      C2 :C11		C2 :C11		C2 :C11
      D2 :D11	Échantillon analytique	D2 :D11	Substance de référence	D2 :D11	Exemple de contrôle
      E2 :E11		E2 :E11		E2 :E11
      F2 :F11	Exemple de contrôle	F2 :F11	Échantillon analytique	F2 :F11	Substance de référence
      G2 :G11		G2 :G11		G2 :G11

      Tableau 2 : Dilutions d’anticorps monoclonaux anti-TNFα. Les dilutions en série d’anticorps monoclonaux anti-TNFα sont mises en évidence dans ce tableau. Les concentrations finales décrites dans ce tableau ne sont pas les concentrations observées dans l’essai, où les anticorps monoclonaux anti-TNFα ont été dilués par un facteur de 3 (dilution des anticorps monoclonaux + milieu de culture + suspension de cellules). Les lignes en gras représentent les dilutions provenant des lignes 3, 5, 7, 9 et 10 ; Les lignes non en gras représentent la dilution des lignes 3, 4 et 6. Ces dilutions en série sont effectuées juste avant d’effectuer le test de neutralisation. Il faut prendre soin de mélanger en pipetant trois fois de haut en bas avant de distribuer les dilutions.

      Colonne de plaque	Volume du milieu de culture d’essai (μL)	Volume de la substance de référence, de l’échantillon analytique ou de l’échantillon témoin (uL)	Concentration dans la plaque d’essai (ng/mL)
      deux	0	230	2000
      3	150	150 depuis la ligne 2	1000
      4	75	75 à partir de la ligne 3	500
      5	100	50 à partir de la ligne 3	333
      6	75	75 à partir de la ligne 4	250
      7	75	75 à partir de la ligne 5	166
      8	75	75 à partir de la ligne 6	125
      9	75	75 à partir de la ligne 7	83
      10	75	75 à partir de la ligne 9	41
      11	150	75 à partir de la ligne 10	13

Résultats

Figure 1 : Disposition des échantillons dans les plaques d’essai. B1 à G11 sont les coordonnées de puits dans les microplaques et décrivent les positions où les dilutions de l’échantillon sont placées. Les coordonnées manquantes sont les puits remplis de témoins et de milieu de culture d’essai (A1-A12 et H1-H12). Cette distribution aléatoire des échantillons (dilutions directes et inverses dan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Cellules de fibrosarcome du mus musculus
RPMI-1640 Moyen	ATCC	30-2001	Conserver le milieu entre 2 °C et 8 °C
RPMI 1640 Medium, sans rouge phénol	GIBCO	Référence 11835-030	Conserver le milieu entre 2 °C et 8 °C
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	GIBCO	Référence 25200-056	Conserver le milieu entre -10 °C et -20 °C
DPBS, sans calcium, sans magnésium	GIBCO	Référence 14190-136	Conserver le milieu entre 2 °C et 8 °C
Protéine TNF-alpha humaine recombinante	Systèmes de R&D	Référence 210-TA-020	Conserver entre -20 °C et -70 °C
Sérum fœtal de bovin (États-Unis), IgG très faibles	HyClone	SH3089803	Conserver entre -10 °C et -20 °C
Sérum fœtal bovin (États-Unis), caractérisé	HyClone	SH3007103	Conserver entre -10 °C et -20 °C
Kit de dosage Caspase-Glo 3/7	Promega	Référence G8093	Stockez le substrat Caspase-Glo. 3/7 et le tampon Caspase-Glo. 3/7 à -20 ºC à l’abri de la lumière
EDTA, sel disodique, dihydraté, cristal, réactif A.C.S.	J.T.Baker	Référence 8993-01	--
Échantillon d’Adalimumab	Probiomed	Na	Les concentrations finales dans la microplaque sont les suivantes : 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 et 0,004 μg/mL
Anticorps monoclonaux de référence et de contrôle Adalimumab	Abbvie	Na	Les concentrations finales dans la microplaque sont les suivantes : 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 et 0,004 μg/mL
Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires	Référence 89429-536	SpectraMax M3 multimode
Logiciel de lecture de microplaques	Dispositifs moléculaires	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
incubateur	Revco	Référence 30482	Revco RNW3000TABB CO2 à air pulsé
Hotte à flux laminaire	La Baker Company	200256	Boulanger SG603A-HE | Haute efficacité, classe II Type A2