Un test in vitro basé sur des cellules dendritiques pulsées par vaccin pour induire la prolifération des lymphocytes

Résumé

Source : Liaqat, F., et al., Détermination de l’immunogénicité vaccinale à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins. J. Vis. Exp. (195), (2023).

Cette vidéo présente un test basé sur le MoDC à base de cellules dendritiques dérivées de monocytes pour mesurer l’immunogénicité de vaccins disponibles dans le commerce. Les tests MoDC étudient les réponses des cellules dendritiques aux antigènes, aux agents pathogènes ou aux traitements et peuvent fournir des informations sur les réponses immunitaires, le développement de vaccins et la recherche en immunothérapie.

Protocole

1. Production de MoDC naïfs

REMARQUE : Des échantillons de sang total ont été prélevés sur un seul veau exempt d’agents pathogènes par ponction de la veine jugulaire avec des vacutainers héparinés (huit tubes sanguins de 9 ml ont été utilisés pour cette étude). Transportez le sang dans une glacière. Conservez les échantillons à une température de 2 à 4 °C pour une utilisation ultérieure, ou traitez-les immédiatement. Gardez le sang en rotation pour éviter la coagulation du sang. Stérilisez les vacutainers avec de l’éthanol à 70 %. Toutes les expériences suivantes ont été réalisées avec un échantillon biologique et six répétitions techniques.

1. Centrifugation à gradient de densité pour isoler les PBMC du sang hépariné
   1. Mélangez bien le sang en l’inversant 10x.
   2. À l’aide d’une pipette de 10 ml, transférez 20 ml de sang hépariné dans un tube stérile de 50 ml et diluez-le avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   3. Pipeter 15 mL de milieu d’isolement lymphocytaire dans un tube stérile de 50 mL.
      note: Laisser le milieu isolant des lymphocytes atteindre la température ambiante avant le pipetage.
   4. Inclinez le tube de 50 mL contenant le milieu d’isolement des lymphocytes à 45°. Pointez l’extrémité d’une pipette de 25 ml perpendiculairement et superposez soigneusement les 30 ml de PBS sanguin sur le milieu d’isolement des lymphocytes, sans mélanger les deux. Très lentement, ramenez le tube de 50 ml en position verticale.
   5. Centrifugeuse à 800 × g pendant 35 min à 20 °C avec accélération maximale et sans freinage (fonction de décélération désactivée).
   6. À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever la couche de PBMC (la fine couche blanche juste après la première couche de plasma) et la transférer dans un nouveau tube de 50 mL.
      note: La centrifugation à gradient de densité sépare le sang total en différentes couches. En conséquence, les érythrocytes se déposent au fond sous forme de pastille, les cellules mononucléées (PBMC) se déposent au niveau de la couche d’interface et le plasma forme la couche supérieure. Les granulocytes se trouvent entre la pastille et la couche PBMC.
   7. Lavez les PBMC récoltés 2 fois en ajoutant du PBS jusqu’à un volume de 40 ml et en mélangeant soigneusement en pipetant de haut en bas. Ensuite, centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 7 min avec une accélération maximale et une décélération maximale.
   8. Jeter le surnageant par décantation, remettre la pastille en suspension dans 15 mL de 1x tampon d’ammonium-chlorure-potassium (ACK) et incuber à température ambiante pendant 10-15 min.
      note: Ne pas incuber plus de 15 minutes. Le tampon ACK disponible dans le commerce est utilisé pour assurer la lyse des globules rouges résiduels (GR) présents dans la fraction PBMC.
   9. Ajouter du PBS jusqu’à un volume de 40 mL, puis centrifuger à 500 × g et 4 °C pendant 7 min avec une accélération et une décélération maximales.
   10. Jetez le surnageant en le transvasant et répétez l’étape 1.1.9.
   11. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de culture complet (à température ambiante).
       note: Le milieu de culture complet est composé d’un milieu de culture cellulaire RPMI 1640 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
2. Séparation magnétique des cellules CD14^+/− de la population PBMC à l’aide de billes magnétiques conjuguées CD14
   1. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules à hémocytomètre propre en utilisant 10 μL de suspension cellulaire mélangée à 10 μL de >REMARQUE : Le colorant bleu de trypan est un produit chimique toxique et potentiellement cancérigène. Ils doivent être manipulés en portant un équipement de protection individuelle (EPI) pour éviter tout contact, et les déchets doivent être jetés dans un contenant hermétique spécialisé pour les déchets toxiques. Les cellules mortes apparaîtront bleues, tandis que les cellules vivantes apparaîtront claires au microscope.
   2. Centrifuger pendant 7 min à 500 × g.
   3. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette et mettez la pastille en suspension dans un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant un volume de 40 μL pour chaque 1 × 10⁷ cellules. Bien mélanger à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Le tampon FACS est composé de 2 % de FBS et de 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dissous dans du PBS.
   4. Ajouter 5 μL de tampon à microbilles CD14 par 1 × 10⁷ cellules et bien mélanger à l’aide d’une pipette.
   5. Incuber pendant 30 min à 4-8 °C pour la sélection positive des monocytes CD14⁺ bovins. Vortex toutes les 15 min pendant la période d’incubation.
   6. Étape facultative (pour l’analyse par cytométrie en flux) : Ajouter 10 μL d’anticorps de coloration CD14-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) avec incubation ultérieure pendant 15 min à 4-8 °C. Reportez-vous à l’analyse par cytométrie en flux à l’étape 5 pour plus de détails.
   7. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifuger pendant 7 min à 500 × g.
   8. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS par 1 × 10⁸ cellules.
   9. Insérez la colonne de séparation des cellules immunomagnétiques dans le séparateur (support de colonne magnétique) et placez un tube de collecte de 15 mL sous la sortie de la colonne pour recueillir le flux.
   10. Lavez la colonne avec 1 mL de tampon FACS dégazé. Après le rinçage, remplacez le tube de 15 ml usagé par un nouveau.
   11. Laisser passer la suspension cellulaire (à partir de l’étape 1.2.8) dans la colonne en pipetant 1 × 10⁸ cellules dans 500 μL de tampon à la fois.
       note: Faites attention à ne pas générer de bulles d’air lors du mélange des cellules avant de les laisser passer à travers la colonne.
   12. Rincez la colonne 3 fois avec 3 ml de tampon FACS dégazé à chaque fois.
   13. Collectez le flux et étiquetez cette première fraction éluée comme la fraction cellulaire CD14 (PBMC moins monocytes CD14⁺) ; on l’appelle également fraction lymphocytaire naïve.
       note: Les cellules CD14⁻ sont maintenues dans un milieu de culture complet jusqu’à ce que des MoDC pulsés par antigène soient produits.
   14. Retirez la colonne du séparateur.
   15. Placer un nouveau tube stérile de 15 mL sous la colonne pour la collecte de l’effluent.
   16. Pipetez 5 ml de tampon FACS dans la colonne et poussez-le immédiatement à l’aide d’un piston.
   17. Collectez le flux et étiquetez cette deuxième fraction éluée comme la fraction cellulaire CD14⁺ ; c’est ce qu’on appelle aussi la fraction monocytaire naïve.
   18. Ajouter un milieu de culture complet aux monocytes CD14⁺ récoltés pour obtenir 1 × 10⁶ cellules/mL.
       note: Compter les cellules vivantes dans la fraction de cellules CD14⁺ éluées afin d’estimer le volume du milieu de culture complet nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité.
   19. Prenez une plaque stérile à 24 puits et ajoutez 1 ml de suspension cellulaire (1 × 10 6 cellules/ml) dans chaque puits.
3. Différenciation des monocytes naïfs de CD14⁺ en MoDC naïfs par l’ajout d’un cocktail de cytokines à 3 % p/v (GM-CSF + IL-4) avec un total de 5 jours d’incubation
   1. Complétez chaque puits contenant des monocytes CD14⁺ avec 40 μL (3 % p/v) du cocktail de cytokines fourni dans le kit.
   2. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ et à 37 °C pendant 48 h.
   3. Le jour 2, transférez la moitié du contenu de chaque puits (500 μL) à l'aide d'une pipette dans des tubes individuels de 1,5 mL et centrifugez à 500 × g à 4 °C pendant 7 min.
   4. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de milieu de culture complet frais.
   5. Transférez 500 μL de cette suspension cellulaire de l’étape 1.3.4 dans chaque puits désigné de sorte que le volume final soit de 1 mL.
   6. Enrichissez chaque puits avec 20 μL de cocktail de cytokines.
   7. Incuber la culture pendant 72 h dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ et à 37 °C.
   8. Après l’incubation du jour 5, retirez la plaque de l’incubateur.
      REMARQUE : Chaque puits contiendra 1 mL d’une suspension cellulaire de MoDC naïfs. Le nombre de MoDC sera un pourcentage (~20 %) des monocytes d’origine plaqués (1 × 10⁶/mL).

2. Génération de MoDC pulsés par antigène

REMARQUE : Un vaccin disponible dans le commerce et cliniquement approuvé contre le virus de la rage (VD) peut induire la différenciation des MoDC naïfs en MoDC matures présentant un antigène. Utiliser 0,1 % (~1 μL) d’une seule dose de vaccin contre le rotavirus pour générer des MoDC à antigène pulsé. De plus, il est préférable de produire des MoDC à impulsions RV dans la même plaque de culture que celle utilisée pour générer des MoDC naïfs, car le transfert des MoDC naïfs sur une nouvelle plaque à 24 puits les affectera négativement.

1. Ajouter 1 μL/mL de suspension de VD à 1 mL de culture de MoDC naïve dans la plaque à 24 puits, et incuber pendant 48 h à 5 % de CO₂ et 37 °C
   REMARQUE : Les MoDC naïfs cultivés sans stimulation RV sont utilisés comme contrôle de fond (et comme stimulation non spécifique pour la co-culture avec des lymphocytes dans les étapes suivantes).
2. Après l’incubation, le jour 7, conservez la plaque à 24 puits contenant les MoDC à impulsions d’antigène sur de la glace pendant 10 min.
3. Ajouter 1 mL de PBS glacé par puits. Bien mélanger chaque puits par pipetage et transférer la suspension dans un tube de 15 ml.
4. Lavez les puits avec 2 ml de PBS glacé pour recueillir les cellules résiduelles laissées dans chaque puits.
5. Transférez le contenu dans leurs tubes respectifs et centrifugez la suspension cellulaire à 500 × g pendant 7 min.
6. Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire (MoDC pulsées par antigène) dans un milieu de culture complet et ajustez le volume à une concentration cellulaire finale de 1 × 10⁵ cellules/mL.
   note: Comptez les cellules vivantes pour estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité. Utilisez des MoDC pulsés par RV à partir du jour 7 pour le système de co-culture MoDC-lymphocytes.

3. Co-culture MoDC-lymphocytes

REMARQUE : Le système de co-culture in vitro MoDC-lymphocytes détermine la capacité des MoDC à amorcer les lymphocytes spécifiques de l’antigène. Les différents groupes de traitement de cellules après 16 jours de co-culture comprennent des cellules spécifiques, non spécifiques et témoins. Le groupe spécifique est défini comme suit : les lymphocytes co-cultivés avec des MoDC pulsés par RV ; le groupe non spécifique est défini comme des lymphocytes co-cultivés avec des MoDC non pulsés par antigène ; et le groupe témoin est défini comme des lymphocytes cultivés sans MoDC.

1. Ajouter un milieu de culture complet à la fraction lymphocytaire naïve éluée (cellules CD14⁻) pour atteindre une concentration cellulaire de 2 × 10⁶ cellules/mL.
   REMARQUE : Comptez les cellules vivantes de la culture cellulaire CD14⁻ qui ont été maintenues dans un milieu de culture complet dans une plaque à 24 puits depuis leur collecte afin d’estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité.
2. Le 7e jour, prendre une plaque stérile à 24 puits et ensemencer les puits avec 1 mL de suspension de cellules lymphocytaires naïves (2 × 10⁶ cellules/mL) et 1 mL de suspension de MoDC pulsée par antigène ou non pulsée par antigène (1 × 10⁵ cellules/mL).
   note: Le volume total dans chaque puits sera de 2 mL avec un rapport de 1:20 MoDC/lymphocytes par puits.
3. Incuber la plaque pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
4. Enrichissement et restimulation de la culture avec des MoDC pulsés par antigène
   1. Après l’incubation de la co-culture de lymphocytes MoDC pulsés par antigène, le jour 9, compléter chaque puits avec 20 ng/mL d’IL-2 recombinante, et poursuivre l’incubation pendant 120 h supplémentaires (5 jours d’incubation).
   2. Le 14e jour, transférer 1 mL de la co-culture dans un tube stérile de 1,5 mL et centrifuger à 500 × g pendant 7 min.
   3. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de MoDC pulsés par antigène ou non pulsés (1 × 10 5 cellules/mL). Mélangez doucement par pipetage et transférez les suspensions cellulaires dans les puits désignés.
      note: À cette étape, le volume total dans chaque puits est de 2 mL.
   4. Poursuivre l’incubation à 5 % de CO₂ et 37 °C pendant 48 h. Après l’incubation au 16e jour, la co-culture est prête pour l’analyse à l’aide de la cytométrie en flux, de la qPCR et de l’ELISA.
      note: Pour chaque 2 mL dans chaque puits de la co-culture MoDC-lymphocytes, 1 mL de cellules remises en suspension est coloré pour la cytométrie en flux, 1 mL est utilisé pour l’extraction de l’ARN et les surnageants des deux sont utilisés pour l’ELISA.

4. Analyse cytométrique en flux

REMARQUE : Colorez les cellules avec les marqueurs/anticorps monogrammes appropriés avant de passer les échantillons sur un cytomètre en flux. Reportez-vous à la table des matériaux pour plus de détails sur les réactifs (contrôles mAb et isotypes de coloration), le kit, l’instrument et le logiciel utilisés pour l’analyse par cytométrie en flux.

1. Protocole de coloration du cytomètre en flux
   note: Effectuez une coloration de surface cellulaire pour les PBMC et les lymphocytes et monocytes naïfs à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-CD14 (étape 1.2.6). Pour la coloration de la surface cellulaire des MoDC naïfs, utilisez des anticorps monoclonaux spécifiques anti-CD86, anti-CD40 et anti-CMH II. Pour la coloration de la surface cellulaire des cellules à partir de co-cultures du jour 16, utilisez des anticorps monoclonaux anti-CD4, anti-CD8 et anti-CD25 ; pour la coloration intracellulaire, utiliser un anticorps monoclonal anti-Ki-67. De plus, colorez les cellules soit avec un contrôle d’isotype négatif, soit sans mAb (FMO : fluorescent moins un). La principale différence lors de la coloration des marqueurs de surface et intracellulaires est que pour les marqueurs de surface cellulaire, les cellules doivent être colorées avec des anticorps monoclonaux de surface spécifiques avant la coloration vivante/morte (L/D) ou tout autre processus. Cependant, la coloration intracellulaire est effectuée après la coloration L/D et nécessite une étape de fixation et de perméabilisation pour permettre la pénétration intracellulaire.
   1. Transférer 1 mL de suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 10 min à 500 × g
      REMARQUE : Après la centrifugation, lors du traitement des cellules de la co-culture MoDC-lymphocytes, conservez le surnageant pour l’analyse ELISA.
   2. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de PBS et transférez-la dans un tube de 15 mL. Récupérez les cellules résiduelles à l’aide de 1 mL de PBS et combinez-le avec la pastille remise en suspension.
   3. Ajouter 10 mL de PBS dans le tube de 15 mL contenant les cellules, mélanger par pipetage et centrifuger pendant 7 min à 850 x g.
   4. Jetez le surnageant et répétez l’étape 4.1.3.
   5. Jetez le surnageant et remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire avec la suspension résiduelle (environ 180 μL) restante après la décantation du surnageant.
   6. Transférez la suspension cellulaire sur une plaque à fond en V à 96 puits et scellez les puits pour éviter les déversements.
   7. Centrifuger la plaque à 1 400 × g pendant 5 min. Après la centrifugation, passez la plaque sur un conteneur à déchets pour vider les puits de liquide, et tapotez la plaque sur du papier absorbant pour assurer l’élimination de l’excès de liquide.
   8. Ajouter 25 μL de mélange maître de coloration de surface par puits et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette, puis laisser incuber à 4 °C pendant 30 min
      note: Pour préparer le mélange maître de coloration de surface pour un seul puits, ajoutez 2,5 μL d’AcM de surface à 20 μL de tampon FACS.
   9. Ajouter 200 μL de tampon FACS par puits et centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min. Après centrifugation, videz les puits de liquide par décantation, et tapotez la plaque sur du papier absorbant pour enlever l’excès de liquide.
   10. Ajouter 100 μL de solution de coloration L/D par puits. Bien mélanger à l’aide d’une pipette, puis laisser incuber à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
       note: Pour un seul puits, dissoudre 0,25 μL de colorant L/D dans 100 μL de tampon FACS. Le colorant L/D permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
   11. Ajouter 100 μL de tampon FACS. Couvrez les puits avec le couvercle et centrifugez la plaque pour 1 400 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant en le transvasant et tapotez la plaque sur du papier absorbant.
   12. Répétez l’étape 4.1.11.
   13. Ajouter 50 μL de solution de fixation par puits (fourni avec le kit), et mélanger à l’aide d’une pipette avant d’incuber la plaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 min.
   14. Ajoutez 150 μL du tampon de perméabilisation-lavage (PW) fourni avec le kit, et couvrez les puits avec le couvercle.
       note: Pour préparer 10 mL de 1 tampon PW, diluez 1 mL de tampon 10 x perm dans 10 mL de dH₂O.
   15. Centrifuger la plaque à 1 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant en le décantant et en tapotant la plaque sur du papier absorbant.
   16. Ajouter 200 μL de 1x PW, puis procéder à une centrifugation à 1 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
   17. Pour la coloration intracellulaire, ajouter 25 μL de mélange maître de coloration intracellulaire (anticorps Ki-67 anti-humain) par puits. Mélangez bien, et incubez la plaque pendant 30 min à 4 °C ou sur glace dans l’obscurité.
       note: Pour préparer le mélange maître de coloration intracellulaire pour un seul puits, ajoutez 1 μL de Ki-67 mAb à 24 μL de 1x PW. Le marqueur de coloration intracellulaire n’est utilisé que lors du traitement des cellules à partir du jour 16 de la co-culture. La coloration intracellulaire n’est pas effectuée lors du traitement des PBMC, des lymphocytes naïfs, des monocytes et des MoDC naïfs.
   18. Après l’incubation, ajouter 200 μL de 1x PW dans chaque puits. Mélanger à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 1 400 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant en le transvasant et tapotez la plaque sur du papier absorbant.
   19. Ajouter 200 μL de tampon FACS, puis procéder à une centrifugation à 1 400 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
   20. Remettez la pastille cellulaire en suspension dans 200 μL de tampon FACS et transférez le contenu de chaque puits dans des tubes de cytomètre en flux stériles séparés. Utilisez 300 μL de tampon FACS par puits pour collecter les cellules résiduelles. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’analyse par cytométrie en flux.
2. Analyse de l’échantillon sur un cytomètre en flux
   note: Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux (à l'aide de lasers de 488 nm, 638 nm et 405 nm) conformément au manuel du fabricant. Reportez-vous au manuel pour plus de détails, le dépannage et la personnalisation du protocole.
   1. Effectuez les procédures de nettoyage habituelles avant et après la lecture des échantillons.
      note: Ne sautez pas de position lors du chargement des tubes dans l’instrument.
      1. Pour le cycle de nettoyage, utilisez un total de quatre tubes, le premier tube contenant du réactif de nettoyage à flux et les trois tubes restants contenant du dH₂O ; chaque tube contiendra 3 ml. Pendant le cycle de nettoyage, acquérez des données avec un débit moyen pendant environ 1 min en capturant 100 000 événements par tube sous 330 V pour la diffusion directe (FSC) contre 265 V pour la diffusion latérale (SSC).
         note: Aucun débris ou événement cellulaire ne doit être signalé pendant le nettoyage ; Si cela se produit, effectuez à nouveau l’étape de nettoyage. Pour l’analyse des échantillons, assurez-vous que tous les échantillons sont dans une suspension homogène avant d’acquérir les données, car cela garantit une lecture précise.
   2. Pour connecter et allumer le cytomètre, cliquez sur le bouton d’application situé dans le coin gauche de la barre de titre. Dans le menu déroulant de l’application, sélectionnez l’option Cytométrie, puis cliquez sur l’option Power On.
      note: Dans le menu déroulant de l’application, l’option Ouvrir permet aux utilisateurs de parcourir les tests préprogrammés, tandis que l’option Nouveau protocole permet aux utilisateurs de créer de nouveaux protocoles.
   3. Chargez d’abord l’échantillon de contrôle négatif dans le support multitube. Sélectionnez Nouveau protocole et observez la liste de travail sur le côté gauche de l’espace de travail/de l’écran.
   4. Sur la liste de travail, définissez la position de l’échantillon dans le support multitube, donnez un nom à l’échantillon et au protocole d’identification.
   5. À partir du panneau matériel situé sur le côté gauche de l’espace de travail, ajustez et sélectionnez plusieurs paramètres tels que les détecteurs (FSC, SSC et 10 gammes de fluorescence), les tensions (V) et les gains des photomultiplicateurs, et la surface-hauteur-largeur (AHW) du signal.
      note: Les réglages suivants pour les détecteurs ont été sélectionnés en fonction de l’expérience et de l’instrument utilisé : FSC-AHW : AHW, V : 270, G : 5 ; SSC-AHW : A, V : 350, G : 10 ; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW : A, V : 400, G : 1 ; FL2 (CD25/PE)-AHW : A, V : 500, G : 1 ; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW : A, V : 700, G : 1 ; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW : A, V : 625, G : 1 ; FL9 (L/D)-AHW : A, V : 425, G : 1.
   6. À partir du panneau de commande d’acquisition d’instruments situé sous la barre de titre, ajustez les options de débit (moyen), de temps (5 min) et d’événements (voir l’étape 5.2.8) à détecter. Cliquez sur l’option Acquérir un seul pour permettre à l’instrument de dessiner/exécuter l’échantillon et d’afficher l’aperçu en temps réel des événements détectés.
   7. À partir de l’aperçu en temps réel, ajustez le seuil de fluorescence (tension et gain) et la taille de la cellule pour finalement dessiner des portes autour de la population cellulaire souhaitée tout en excluant tout débris cellulaire.
      note: Le FSC aide à distinguer les cellules en fonction de leur taille, permettant ainsi aux utilisateurs de différencier les cellules du système immunitaire, telles que les monocytes et les lymphocytes ; les monocytes sont plus gros et présentent une intensité FSC plus élevée que les lymphocytes.
   8. Acquérez un total d’environ 5 000 MoDC vivants, 50 000 lymphocytes vivants et 50 000 événements monocytaires vivants.
   9. Une fois que tous les paramètres sont ajustés en référence à l’échantillon de contrôle négatif, cliquez sur Stop, et enregistrez le protocole.
   10. Chargez maintenant tous les échantillons sur le chargeur multitube. Définissez chaque échantillon de la liste de travail et appliquez les paramètres ajustés en référence au contrôle négatif à tous les échantillons de l’expérience. Cliquez sur l’option Acquérir pour permettre à tous les échantillons de l’expérience d’être exécutés consécutivement.
   11. Une fois les données de tous les échantillons acquises, enregistrez-les et transformez-les en données lisibles à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié qui permet de générer des histogrammes séquentiels bi-paramétriques et mono-paramétriques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon de lysage ACK	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Tampon d’ammonium-chlorure-potassium pour la lyse des globules rouges résiduels dans la fraction PBMC récoltée
Kit de croissance de cellules dendritiques bovines	Bio-Rad, Royaume-Uni	PBP015KZZ	Cocktail de cytokines composé d’IL-4 bovine recombinante et de GMCSF
Kit ELISA IFN-γ bovin	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Utilisation du kit pour mesurer l’expression de l’IFN-γ dans le surnageant de culture
Nobivac Rage	MSD Animal Health, Royaume-Uni		1 μL/mL de vaccin inactivé en culture cellulaire contenant > souche du virus de la rage 2 UI/mL
Scellés optiques	Bi0-Rad	TCS0803	Tube PCR plat de 0,2 mL Bandes à 8 capuchons, optiques, ultra-claires, compatibles avec la machine qPCR
Tampon phosphate salin (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7,4, concentration 1x
Tube FlowTubes/ FACS (tri unicellulaire activé par fluorescence)	Faucon Corning	352235	Tube à essai en polystyrène à fond rond de 5 mL, avec capuchon à pression pour crépine de cellule, utilisation pour l’analyse par cytométrie en flux
Microbilles CD14 humaines	Miltenyi Bioteck, Allemagne	Tél. : 130-050-201	2 mL de microbilles conjuguées à l’isotype IgG2a de l’anticorps monoclonal anti-CD14 humain, utilisées pour la sélection des monocytes bovins à partir de PBMC
Anticorps anti-humain Ki-67 purifié	Biolegend, États-Unis	350501	Anticorps monoclonal, croisé avec une vache, clone ki-67
RPMI 1640 Moyen	Sigma Aldrich	R8758	Milieux de culture cellulaire avec L-glutamine et bicarbonate de sodium
Plaque d’essai pour culture tissulaire 24	TPP, Suisse	Référence 92024	Plaque à 24 puits, stérilisée par rayonnement, traitement avec croissance améliorée, volume 3,18 mL