Un test de perturbation des hémocytes pour évaluer la réadhésion des hémocytes aux poches hématopoïétiques

Résumé

Source : Petraki, S. et al., Dosage des populations de cellules sanguines de la larve de Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

Cette vidéo montre le test de perturbation des hémocytes, évaluant la réadhésion des hémocytes dans les poches hématopoïétiques des larves de drosophile. Les perturbations mécaniques libèrent des hémocytes résidents, ce qui augmente le nombre d’hémocytes circulants. Après la guérison, la réadhésion des hémocytes résidents est confirmée, illustrant la réversibilité.

Protocole

1. Essai de saignement/raclage des hémocytes

1. Préparation des diapositives :
   1. Option 1 pour les microscopes sans fonction de balayage des carreaux : Pour chaque larve à analyser, préparer une lame de verre avec environ 5 puits de stylo Pap de carrés de 2 mm chacun, correspondant à la zone d’observation sur le terrain du microscope ; ajouter environ 5 à 10 μl de milieu S2 à chacun (figure 1A). Conservez les lames dans une chambre humide pour éviter que les puits ne se dessèchent.
   2. Option 2 pour les microscopes avec fonction de balayage des tuiles : Pour chaque larve à analyser, préparer une lame de verre avec 3 à 4 puits de stylo Pap de carrés de ~3 à 4 mm chacun ; ajouter environ 15 à 20 μl de milieu S2 dans chaque puits (figure 1B). Conservez les lames dans une chambre humide pour éviter que les puits ne se dessèchent.
      note: Le nombre de puits recommandé ci-dessus est suffisant pour un total allant jusqu’à 3 000 hémocytes par larve (larves du 2e^stade tardif, ~2,5 à 3 mm de longueur, transgène marquant la majorité des cellules sanguines larvaires). Lors de l’évaluation d’un plus grand nombre de cellules sanguines, plus de puits peuvent être nécessaires pour éviter la surpopulation.
2. Collecte des larves :
   1. Versez de l’eau dans une fiole de mouches contenant des larves et rincez les larves dans une boîte de Pétri, ou versez de la nourriture contenant des larves dans une boîte de Pétri et diluez-la avec de l’eau à l’aide d’une bouteille de pétri
   .
   2. Prélevez délicatement les larves dans la boîte de Pétri à l’aide d’un pinceau et placez-les dans l’eau dans une cavité ou sur une lame sur un bloc froid.
      note: Les larves peuvent être conservées pendant un temps limité dans l’eau ou sur un bloc froid ; Utilisez les échantillons dans les 45 minutes ou moins pour éviter la mort des larves ou des effets indésirables sur les hémocytes.
3. dissection:
   1. Sélectionner les larves au microscope à fluorescence sur un bloc de métal froid. Mesurez la taille et imagez les larves si vous le souhaitez.
   2. Isolement des hémocytes circulants (« Bleed ») :
      1. Une fois les larves sélectionnées, placez une larve dans le premier puits (figures 1C, 2A).
      2. Utilisez 2 aiguilles propres ou des ciseaux et une pince à disséquer pour faire une incision aux extrémités postérieure et antérieure de la larve. Pour éviter de déranger les hémocytes résidents, il est préférable de faire ces incisions sur la face ventrale de la larve. Pour des résultats cohérents, faites les incisions aux mêmes endroits pour chaque larve. Pour les larves du^1er stade, 1 incision (dans la partie antérieure ventrale) suffit.
      3. Laisser la larve saigner pendant quelques secondes sans pression ni agitation physique (Figure 2A).
         note: Si vous travaillez sur plusieurs larves, il est préférable de faire ces incisions pour chacune d'entre elles avant de passer à l'étape suivante afin d'éviter de garder les larves sur la glace trop longtemps, ce qui pourrait affecter l'intégrité des échantillons.
      4. Soulevez doucement la larve à l’aide des aiguilles ou de la pince et plongez-la dans le deuxième puits pour rincer les hémocytes circulants restants. Après cela, poursuivez avec la libération des hémocytes résidents.
   3. Isolement des hémocytes résidents (« Scrape ») :
      1. Transférez doucement la larve dans le puits suivant (figure 2C).
      2. Identifiez la glande lymphatique de la larve, qui est généralement située à environ 1/3 de l’extrémité antérieure de la larve, et qui peut émettre une fluorescence dorsale à travers la paroi du corps larvaire. Évitez la glande lymphatique tout en libérant les hémocytes résidents en épinglant la larve à l’aide d’une aiguille le plus près possible de la glande lymphatique pour éviter la perforation (figure 2C).
         note: Au cours du développement normal, la maturation des hémocytes des glandes lymphatiques est retardée par rapport aux hémocytes larvaires, et les rapporteurs fluorescents des hémocytes différenciés peuvent ne pas montrer de signal dans les ganglions lymphatiques des jeunes larves. Dans ces cas, il faut accorder moins d’attention aux glandes lymphatiques, car on ne s’attend pas à ce qu’il y ait contamination des hémocytes larvaires différenciés marqués par fluorescence par des hémocytes des glandes lymphatiques.
      3. Libérer les cellules sanguines résidentes dans un processus de dissection de grattage et/ou de piqûre. Utilisez une pointe d’aiguille pour épingler efficacement la larve près de la glande lymphatique (voir ci-dessus) ou d’autres zones du corps au besoin. À l’aide d’une autre aiguille, on tape sur les grappes d’hémocytes visibles à travers la paroi du corps larvaire (figures 2C et E) dans le but de séparer les hémocytes. Les hémocytes peuvent également être libérés dans un mouvement de grattage. Cependant, une déchirure précoce de l’épiderme peut libérer de gros amas de cellules sanguines, ce qui pourrait rendre le comptage automatisé plus difficile.
         note: En fonction de l’âge et du génotype de la larve, le nombre total d’hémocytes variera. Répartissez le processus de libération décrit ci-dessus sur plusieurs puits afin d’éviter l’encombrement de certains puits avec des cellules sanguines, ce qui pourrait rendre plus difficile l’analyse d’images unicellulaires.
      4. S’il reste peu d’hémocytes dans la carcasse finale, compter ces hémocytes par observation au microscope et à l’aide d’un compteur manuel (figure 2E). Pour faciliter le comptage, placez la carcasse sur une zone propre de la même lame et étalez-la aussi finement que possible pour réduire le nombre de plans optiques.
      5. Une fois la dissection terminée, attendez entre 5 et 10 minutes que les cellules se stabilisent (mais n’adhèrent pas nécessairement) avant d’imager les puits. Incuber la lame dans une chambre humide pour éviter le dessèchement, et éviter une manipulation brutale des lames, ce qui pourrait perturber les hémocytes installés.
         note: Lors de la détermination du nombre d’hémocytes, les cellules libérées ne sont pas fixes et les cellules doivent être imagées peu de temps après la dissection, de préférence dans les 30 minutes suivant la libération de la larve. En fonction du volume du milieu et des propriétés cellulaires, la grande majorité des cellules se seront stabilisées en 5 à 10 minutes, ce qui devrait être confirmé en se concentrant à travers les plans optiques du milieu dans le puits. Cependant, seule une fraction des cellules sanguines aura adhéré à la surface de la lame à ce moment-là, un fait qui doit être pris en compte si l’on modifie ce protocole pour les approches basées sur la fixation cellulaire.
4. quantification:
   1. Prenez des images des hémocytes stabilisés au microscope fluorescent (Figure 2B, D, F). Poursuivez avec la quantification des hémocytes à l’aide du logiciel ImageJ.
   2. Préparez l’image pour l’algorithme de comptage de cellules ImageJ :
      1. Ouvrez l’image du puits à l’aide de ImageJ : Fichier → Ouvrir → (localisez le fichier et sélectionnez).
      2. Assurez-vous que la ou les images sont 8 bits ou 16 bits. Ajustez le seuil de l’image en sélectionnant Image, puis cliquez sur Ajuster et sélectionnez Seuil. Observez la « fenêtre de seuil » (Figure 3A).
      3. Cochez l’option « Fond sombre ». Sélectionnez « Rouge » et augmentez le niveau de seuil inférieur (voir flèche noire) jusqu’à ce que chaque cellule de l’image soit marquée d’un point rouge (les cellules qui ne sont pas couvertes seront visibles en niveaux de gris ; Figure 3B). Au fur et à mesure que le seuil inférieur est augmenté, certaines cellules ne seront plus marquées. Il peut s’agir d’un indicateur de la distance à laquelle définir le seuil inférieur.
         note: Parfois, les amas de cellules ne peuvent pas être résolus et sont comptés comme un par le compteur de particules. Dans ce cas, le nombre de cellules d’un cluster peut être estimé en examinant l’image (zoom avant si nécessaire) et en comptant manuellement à l’aide d’un compteur de compteurs. Alternativement, le seuil inférieur peut être augmenté pour résoudre les groupes de cellules ; Les cellules non marquées résultant de cette manipulation peuvent ensuite être comptées à l’aide d’un compteur de pointage.
   3. Analysez le numéro de cellule à l’aide d’ImageJ :
      1. Lancez l’analyseur de particules pour compter les cellules (Figure 3C). Sélectionnez Analyser et cliquez sur Analyser les particules. Sélectionnez éventuellement « Superposer les contours » pour voir les particules comptées par l’algorithme (Figure 3D). Vous pouvez également définir une limite à la taille ou à la surface des pixels d’une unité (par exemple, une cellule, un groupe de cellules, etc.) pour que l’algorithme puisse compter.
      2. Cliquez sur OK. Observez une fenêtre récapitulative avec le décompte (Figure 3E).

2. Dosage de la perturbation des hémocytes

1. Pour perturber les hémocytes, sélectionnez les larves et placez-les dans un tube de microcentrifugation de 2 ml avec environ 0,5 g de billes de verre (212 - 600 μm) et ajoutez 0,5 ml d’eau.
2. Vortex le tube, à la main, à vitesse 10 pendant 1 min.
3. Récupérez les larves des billes de verre en renversant le contenu du tube de microcentrifugation dans une boîte de Pétri et en prélevant les larves avec un pinceau.
4. Pour la phase de récupération, placez les larves dans des boîtes de Pétri préalablement préparées avec de petites quantités de nourriture pour mouches. Laisser les larves rétablir leur schéma hémocytaire pendant une période de 45 min ou au besoin.
   note: Jetez toutes les larves qui ont cessé de bouger, car elles sont mortes dans le processus. Cependant, nous voyons généralement peu de dommages après 1 minute de vortex.
5. Après la période de récupération, poursuivre le dosage de saignement/éraflage comme décrit ci-dessus à la section 1.

Résultats

Graphique 1. Configuration et schéma du test de saignement/éraflure et de perturbation des hémocytes. (A)Configuration de la diapositive d’image unique : cinq carrés de 2 mm pour l’imagerie avec un objectif 5X. (B) Configuration de la diapositive de numérisation de tuiles : quatre carrés de 3 mm pour l’imagerie des saignements/éraflures de larves de ≤2,5 mm avec un microscope ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri de 6 cm/9 cm			Un pour chaque génotype à évaluer
Bouteille d’eau
Cuillère/spatule en métal
Pinceau fin			par exemple un « liner »
Plat à cavité en verre
Stylo PAP : Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Glissières en verre			Chaque diapositive aura 5 carrés de PEN PAP ou plus dessinés dessus. La taille des carrés dépend de l’objectif d’imagerie et du grossissement de la caméra du microscope ; par exemple carrés de 2 mm.
Chambre humide			Cela sera utilisé pour éviter que les glissières et les puits ne se dessèchent : récipient scellé avec des serviettes en papier humides bordant les côtés/fond
Milieux de culture de cellules de drosophile de Schneider	Invitrogen
Bloc froid			Il s’agit d’un bloc métallique (c’est-à-dire un bloc chauffant) refroidi dans un seau contenant de la glace, de préférence de couleur noire ou d’une autre couleur sombre et non réfléchissante
Deux seringues de 1ml avec aiguilles (27G 1/2)	Becton Dickinson		Pour les dissections.
En option : Ciseaux chirurgicaux à ressort (tranchant 2 mm)	Outils scientifiques fins
Perles de verre, 212-600 microns	sigma
Tubes Eppendorf de 2 ml	Eppendorf		Un par génotype d’évaluation
Mélangeur Vortex	Fisher Scientific
Larves de drosophile transgéniques avec des hémocytes marqués par fluorescence. Les transgènes appropriés comprennent : HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP et -GFP (Gajewski et al., 2007), ou HmlΔ-GAL4 (Sinenko et Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (par H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), ou eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combiné à UAS-GFP ou à d’autres transgènes de protéines fluorescentes.
Microscope de dissection à fluorescence	Leica		Ici : Leica M205, en option avec appareil photo, logiciel d’imagerie et module de mesure
Microscope à fluorescence inversée avec caméra	Leica ou Keyence		Avec ou sans fonction de balayage de tuiles (par ex. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)