Un test de perturbation des hémocytes pour évaluer la réadhésion des hémocytes aux poches hématopoïétiques

Résumé

Source : Petraki, S. et al., Dosage des populations de cellules sanguines de la larve de Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

Cette vidéo montre le test de perturbation des hémocytes, évaluant la réadhésion des hémocytes dans les poches hématopoïétiques des larves de drosophile. Les perturbations mécaniques libèrent des hémocytes résidents, ce qui augmente le nombre d’hémocytes circulants. Après la guérison, la réadhésion des hémocytes résidents est confirmée, illustrant la réversibilité.

Protocole

1. Essai de saignement/raclage des hémocytes

1. Préparation des diapositives :
   1. Option 1 pour les microscopes sans fonction de balayage des carreaux : Pour chaque larve à analyser, préparer une lame de verre avec environ 5 puits de stylo Pap de carrés de 2 mm chacun, correspondant à la zone d’observation sur le terrain du microscope ; ajouter environ 5 à 10 μl de milieu S2 à chacun (figure 1A). Conservez les lames dans une chambre humide pour éviter que les puits ne se dessèchent.
   2. Option 2 pour les microscopes avec fonction de balayage des tuiles : Pour chaque larve à analyser, préparer une lame de verre....

Résultats

Graphique 1. Configuration et schéma du test de saignement/éraflure et de perturbation des hémocytes. (A)Configuration de la diapositive d’image unique : cinq carrés de 2 mm pour l’imagerie avec un objectif 5X. (B) Configuration de la diapositive de numérisation de tuiles : quatre carrés de 3 mm pour l’imagerie des saignements/éraflures de larves de ≤2,5 mm avec un microscope .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri de 6 cm/9 cm			Un pour chaque génotype à évaluer
Bouteille d’eau
Cuillère/spatule en métal
Pinceau fin			par exemple un « liner »
Plat à cavité en verre
Stylo PAP : Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Glissières en verre			Chaque diapositive aura 5 carrés de PEN PAP ou plus dessinés dessus. La taille des carrés dépend de l’objectif d’imagerie et du grossissement de la caméra du microscope ; par exemple carrés de 2 mm.
Chambre humide			Cela sera utilisé pour éviter que les glissières et les puits ne se dessèchent : récipient scellé avec des serviettes en papier humides bordant les côtés/fond
Milieux de culture de cellules de drosophile de Schneider	Invitrogen
Bloc froid			Il s’agit d’un bloc métallique (c’est-à-dire un bloc chauffant) refroidi dans un seau contenant de la glace, de préférence de couleur noire ou d’une autre couleur sombre et non réfléchissante
Deux seringues de 1ml avec aiguilles (27G 1/2)	Becton Dickinson		Pour les dissections.
En option : Ciseaux chirurgicaux à ressort (tranchant 2 mm)	Outils scientifiques fins
Perles de verre, 212-600 microns	sigma
Tubes Eppendorf de 2 ml	Eppendorf		Un par génotype d’évaluation
Mélangeur Vortex	Fisher Scientific
Larves de drosophile transgéniques avec des hémocytes marqués par fluorescence. Les transgènes appropriés comprennent : HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP et -GFP (Gajewski et al., 2007), ou HmlΔ-GAL4 (Sinenko et Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (par H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), ou eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combiné à UAS-GFP ou à d’autres transgènes de protéines fluorescentes.
Microscope de dissection à fluorescence	Leica		Ici : Leica M205, en option avec appareil photo, logiciel d’imagerie et module de mesure
Microscope à fluorescence inversée avec caméra	Leica ou Keyence		Avec ou sans fonction de balayage de tuiles (par ex. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)